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(無題) 削除/引用 No.1759-12 - 2008/08/14 (木) 12:06:47 - おお もし、特定のプライマーだけでその失活が起きているのなら、なにか分からない要因で配列依存的に起こっている可能性も非常に低いですけど捨て切れないとも思えます。プライマー同士がなにかワトソンクリックのらせん構造以外の複雑な構造を取り得て、保存の仕方、凍結融解などによってそういう構造を徐々に取るようになるとか、、、特定のプライマーだけ起こるのであれば思い切ってプライマーの配列を変えてみてはどうかともおもいます。 プルフリーディング活性のあるPCR酵素がコンタミしているということは無いですよね。この酵素はその性質状DNAを削るでしょうから。

(無題) 削除/引用 No.1759-11 - 2008/08/14 (木) 10:23:05 - RD ただの凍結融解のし過ぎって線では・・・ プライマーの末端が削れて掛かりにくくなってるのではないでしょうか

~さん 削除/引用 No.1759-10 - 2008/08/14 (木) 10:03:35 - ｙ２ ~さん　 それが笑うに笑えないんです....... 今回「失活」したのは、ストックを作って 小分けにしたもののうちの一つです。 残りは鍵つきの箱に入れておいたのですが、 一つだけ使用している最中で、箱の外に 出しておいたものが「失活」しました。 鍵付きで保管しておいたプライマーと、 「失活」したプライマーとで 同時・同条件でPCRをかけると、 鍵付きの方は全く問題なくかかりますので、 DNAの側に問題はないと思います。 プライマーはすぐに新しいものを注文し直しました。

(無題) 削除/引用 No.1759-9 - 2008/08/14 (木) 09:32:51 - ~ >ラボの後輩にチューブにEDTAをたくさん入れられた。 いや、これは半分以上冗談ですよ。 ある程度自由にプライマーを購入できるのであれば、 同じプライマーを発注して、新旧で比較してみてはいかがでしょうか。 おそらく、ストックを作ってそこから小分けというやり方はしていないのですよね。

(無題) 削除/引用 No.1759-8 - 2008/08/13 (水) 23:09:54 - in situ 確認というのは、cDNAからクローニングして、mini or midi prepしたプラスミドの確認をPCRで行ったということでしょうか？ 保存しておいたcDNAに対して再びPCRを行ってかからなかったということであれば、cDNAの分解の方が先に考えられると思います。

ありがとうございます 削除/引用 No.1759-7 - 2008/08/13 (水) 20:09:09 - ｙ２ 皆さんアドバイスありがとうございます。 まず、うまく表現する言葉を思いつかなかったので 「失活」という言葉を使いました。DSCさん、ご指摘恐れ入ります。 今回のような突然の「失活」はこれまでに３度ありました。 溶媒は滅菌水、保存は−２０℃です。 １回目はcDNAからのクローニング、今回・前回は確認のためでした。 特にトリッキーな条件設定をしているということもないと思いますし、 プライマーはきちんと溶かして使っています。 全く同じ時、同じ会社から購入した全く同じプライマーで、 パッケージを開けていないものは問題なくかかりました。 実は~さんが書いておられた、 「ラボの後輩にチューブにEDTAをたくさん入れられた」が 否定できない状況です。これまではまさか、と思っていましたが さすがに３回目ですし、今まではプライマーで済んでいたからよかった ものの、サンプルなんかにいたずらされたのではたまりませんので （サンプルや抽出DNAは鍵付き箱で保管していますが） ボスに相談するつもりなのですがことがことなので、 自分のミスとして考えられる可能性を確かめておこうと思い、 ここに書き込んだ次第です。 明日、もう一度実験内容の再確認等を行い、 ボスに相談してみようと思います。 .....でも、同じラボで、他人のプライマーなどに いたずらするなんてあるんですかね？　憂鬱ですが。

(無題) 削除/引用 No.1759-6 - 2008/08/13 (水) 13:23:22 - ~ ちゃんと溶けていないまま使って、濃度が大きく変わった。 実は微妙な温度加減で増えていたPCRで、気温の違いなどで増えなくなった。 ラボの後輩にチューブにEDTAをたくさん入れられた。 こういう場合で、原因がちゃんと分かることは早々無いと思います。

(無題) 削除/引用 No.1759-5 - 2008/08/13 (水) 13:08:19 - おお DNaseのコンタミと言うのが私も一番考えられる理由のようにおもえますが、そんなに起こるものでもないようにもおもえます。特定のプライマーがよくおかしくなるというのであれば、プライマーよりもそのプライマーを使った条件がトリッキーであるとかいうのも考えた方がいいかとも思います。 DNaseのコンタミを気にするのなら、もし使ってないようであれば滅菌水やTEを使って溶解するのがいいと思います。EDTAはキレーターでその作用のため、DNaseの活性を阻害するのはご存じと思います。DNA中心の仕事をしているひとで水という水は問題がない限り0.1mM EDTA(0.1xTE)に置き換えて実験しているという人もいますね。 まさかとは思いますが、凍結から戻した時の溶液が完全に解けてないのに、そこから取り出して使っているていうことはないですか?ないと思いますが、、、、、 ほかの人のコメントのように(PCR以外の余程微妙な実験をしてない限り)そんなに変になるものでもないので、その他の原因も重ねてチェックされた方がいいかと思います。

(無題) 削除/引用 No.1759-4 - 2008/08/13 (水) 11:42:11 - A 文章を読んだ限りではプライマーを使ってどの様な実験をされているのか はっきりしませんが（cDNAからのクローニング、確認のためのPCR、 プライマーをアニーリングさせてのコンストラクション、ミュータント 作成など）どの実験にせよ先週の土曜日まで問題なかったプライマーが たった３日間で使い物にならなくなる可能性は限りなく０に近いように 思います。閉鎖系で合成されたプライマーですよね？仮に-20度なり-80度の フリーザーに問題起きて一度融解してもそう簡単に使い物ににらなくなる ことは無いでしょう。間違ってそんなに早くDNAが使い物にならなくなると すればDNaseのコンタミぐらいしか考えられません。その可能性はありますか？結論から言うとトラブルの原因はプライマー以外にあると考えるのが 妥当でしょう。落ち着いてもう一度実験内容を確認してどの様なコント ロールをとったのか、プライマーの失活以外に考えられるトラブルの可能性 が何なのかなどを同僚なり指導教官なりと話し合うのが一番いいでしょう。 詳しい実験内容を書かない限りここからはなかなか良いアドバイスを 得られないと思いますしその時間を使って研究室の人と話し合った方が 解決が早いと思います。

(無題) 削除/引用 No.1759-3 - 2008/08/13 (水) 11:39:25 - EcoRI プライマーが溶けている溶媒(滅菌水だと思いますが)や 保存方法(冷蔵？冷凍)や、どうやってダメであることを確認したのかを 明示なさるといいと思います。 一番簡単に思いつくのは、DNaseのコンタミでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.1759-2 - 2008/08/13 (水) 11:34:29 - DSC あまり正統派な回答ではないかもしれませんが、、 私は、PCRがかからなくなったとき、プライマー溶液（PCR用に10uMに希釈したもの）を70-90℃で2-3分加熱し、氷で急冷してからPCRに用いるとうまくかかった経験が何度かあります。理屈はどうであれ、簡単なので、試してみる価値はあると思います。 ところで、オリゴヌクレオチドは酵素ではありませんから、PCRがかからなくなったときに「失活」という表現はいかがなものでしょうね。

プライマーの突然の失活 削除/引用 No.1759-1 - 2008/08/13 (水) 11:13:48 - ｙ２ 先週土曜日までプライマーは問題なしでした。 今週の月曜から突然そのプライマーが 効かなくなりました。 DNAには問題ないことは確認済みです。 同じ保管場所にあった他のプライマー、 同じプライマーでも別容器のものは 失活していません。 プライマーが突然効かなくなる理由は 何が考えられるでしょうか。 こういうことが何回もあり、 困っております。 お知恵をお貸しいただければ嬉しいです。

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