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(無題) 削除/引用 No.1763-3 - 2008/08/14 (木) 22:55:09 - しちみ BAPほどではないですが、CIAPもしつこい酵素ですね。 私も苦労した記憶があります。 PNKが一本鎖を好むのは、おお　さんのおっしゃるとおりで、ラベル化が単純なハイブリプローブであれば一本鎖に変性させてからのほうが効率がいいです。 逆に２本鎖だけにラベルを入れる必要があるのなら、期せずして変性した１本鎖のほうに高率で入ってしまうので、ラベル化後になんらかの精製工程が必要になるかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.1763-2 - 2008/08/14 (木) 12:29:34 - おお PNKは、5'末端が突出しているか、一本鎖のとき効率よく入る酵素ですのでEcoRIの末端はよく入るはずです。 原因として考えられるのは脱燐酸化処理がうまくいっていないが、CIAPが失活せず、溶液中に残っているなどではないかと思われます。CIAPなどの脱燐酸化酵素は意外としぶとくて問題になることがあると聞いています。脱燐酸化酵素処理後プロテイナーぜK処理をして脱燐酸化酵素を殺す人もいるかと思います。 >EcoRI制限酵素などのDNA断片（複数。〜10個くらい） 末端が、コヘッシブなため会合しているかもしれませんので、処理をする前に少し温めて急冷してもいいかもしれません。

DNAに効率よくラベルが入りません！（泣TT） 削除/引用 No.1763-1 - 2008/08/14 (木) 09:15:47 - 突出末端 5'突出末端を生成するEcoRI制限酵素などのDNA断片（複数。〜10個くらい）に、Polynucleotide kinaseでP32標識しようとしているのですが、効率よくラベルが入りません。 FermentasのPolunucleotide kinaseを用い、まずCIPで脱リン酸化、フェノール処理し、Forward reactionでラベルを入れようとしています。 ためしに、１本鎖合成DNAをラベルしたら良くラベルが入り、アニールした２本鎖（末端は平滑）ではラベルがほとんど入りませんでした。 なにか、私が勘違いしていることがありますでしょうか？　メーカ特異的な問題はありますでしょうか？　またExchange　reaction　（交換反応）でやるのはどうなのでしょうか？　ひとつでもアドバイスがありましたらお願いします。

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