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(無題) 削除/引用 No.1862-7 - 2008/09/12 (金) 10:34:16 - 通りすがり うまくいってるようでよかったですね。 >又、通りすがりさんに質問なんですが、 >internal controlとして挙げて下さった、calreticulinに関する >論文が、あまりCYPのウェスタン測定の論文には出ていなかったため >担当の先生から許可がもらえなかったのですが。。 >もし参考になるものがあれば、お手数ですが >教えていただけますでしょうか？ 必ずしもcalreticulinでなくても小胞体に恒常的に局在してるもので (Grp78とか)あれば他のもcontrolになります。 一応参考文献としては Diabetes 53:185-194, 2004 JBC, 281:5128-5136, 2006 とかでしょうか、 他にもいろんな種類のcontrolが たくさんでてるので実験に適したものを探してみてください。

沢山のコメントを頂きましてありがとうございました。 削除/引用 No.1862-6 - 2008/09/12 (金) 00:55:43 - M×Ｍ さっそく、みなさんのご指摘通り、 抽出の過程を改善しました。 Tris中(protease inhibitorを含む)でよくホモジナイズして、 その後10000gで遠心してミトコンドリアや核とそれ以外のfractionを分離、細胞質を含む上澄を超遠心して落ちてきた沈殿を解析に使用しようと思います。 この方法で、やっとCYPのバンドが見れたので 皆さんに本当に感謝しています。 又、通りすがりさんに質問なんですが、 internal controlとして挙げて下さった、calreticulinに関する 論文が、あまりCYPのウェスタン測定の論文には出ていなかったため 担当の先生から許可がもらえなかったのですが。。 もし参考になるものがあれば、お手数ですが 教えていただけますでしょうか？ 又、丁寧にアドバイス頂きまして、本当にありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.1862-5 - 2008/09/01 (月) 14:41:40 - 通りすがり 昔ラットで同様にミクロソームを分画しCYPの発現や活性などを調べてましたが、他のかたがおっしゃるように最初のほうのstepでRIPAのように界面活性剤などを含むbufferを使うところが今回の場合あまり適切ではありません。 昔やってた方法ですが、単純にPBS中(protease inhibitorなどを含む)に肝臓を浸した状態でよくホモジナイズして、その後9000-10000gで遠心してミトコンドリアや核とそれ以外のfractionを分離して、細胞質を含む上澄を超遠心して落ちてきた沈殿を粗ミクロソーム分画として解析に使ってました。CYPなどについてはwesternなどをするならここにRIPAなどを加えて抽出すれば全然OKです。 核などの成分と異なり、膜成分の分離のときは界面活性剤や高濃度の塩などはむしろ抽出効率を下げるので単純にPBSとかTrisに混ぜた状態で遠心して粗分画していってから可溶化するほうほうが原始的ですがわりと綺麗にいきます。 あとinternal controlはactinとかtublinのような一般の細胞質タンパクに用いられるcontrolは向きません。よく使われるのはERに存在するcalreticulinなどですね。 それと薬学・生化学系のjournalによってはミクロソームを用いる実験の場合それ以外の分画にCYPが残っておらずミクロソームを用いた解析での定量性が信頼できるかどうか自体を問われるときもあるので それぞれのペレットや上澄みは必ず残しといて各分画のマーカーなどを用いて分画調整が適切にできてるかなどcheckしておいたほうが良いですよ。

(無題) 削除/引用 No.1862-4 - 2008/09/01 (月) 13:54:54 - 名無し ミクロソーム画分は膜画分ですから分離に際して界面活性剤を使うのは適切でないと思います。特に比較的強いデオキシコール酸やNP-40など含むRIPA bufferだとおそらく小胞体膜は溶けてなくなってしまい、その時点でCYPは可溶性画分に行ってしまうのではないかと想像します。つまりはじめの10000xg5分の遠心の上清にあるのではないかと思います。いまいちど実験書でミクロソーム画分の正しい分画法を確認してみることを勧めます。

(無題) 削除/引用 No.1862-3 - 2008/09/01 (月) 03:40:24 - おお >[Re:1] M×Mさんは書きました : > どなたか、CYPを測定している方でポジティブコントロールを何を使っているのか(今回はβactinを考えているのですが、ミクロソーム分画に存在しないのかうまくいきません)、 インターナルコントロールですよね、、、 もしプレパレーションが安定しているのであれば、同じタンパク量で比較すればいいかと思いますが。それと CBB染色で染色されるタンパクのパターンが変わらなければプレパレーションが安定している根拠の一つになると思いますが、、、、、

(無題) 削除/引用 No.1862-2 - 2008/09/01 (月) 03:34:12 - おお プレパレーションをうかがうのであれば、最初の遠心のペレットと上ずみ、あるいは組織(細胞)いきなりサンプルバッファーで溶解したものなどプレパレーションにそって目的のものが的確に、考えているフラクションに来ているか見てみるのがいいかと思います。 もしかしたらRIPAはちょっと強すぎて、膜成分を溶解してしまっているかもしれません。そういう事が、上記の方法で分かる可能性があると思いますし、そうすると解決方法も考えることができると思いますが、、、 あとポジコンは実験によりけりですので、その抗体を使っている文献など調査してみればいいかと思います。

肝臓の酵素CYPのウェスタンブロットでの検出 削除/引用 No.1862-1 - 2008/09/01 (月) 02:52:39 - M×M マウスの肝臓の酵素CYP3A4、2D6、1A2のウェスタンでの検出をしているのですが、なかなかうまくいきません。。 どなたか、CYPを測定している方でポジティブコントロールを何を使っているのか(今回はβactinを考えているのですが、ミクロソーム分画に存在しないのかうまくいきません)、 ミクロソーム分画の抽出の仕方で良い方法をご存知の方いらっしゃいましたらご教授頂けたら幸いです。 ちなみに私は抗体の説明書に 1次抗体:100〜1000倍 2次抗体:2000〜100000倍 が推奨と書かれていたので 1次抗体:200倍 2次抗体:60000倍 で行い、化学発光はECL Plusを使い、露光時間を5，10，15分で見ています。 ミクロソームの抽出のやり方としてはRIPAbufferを加えホモジした後 10000G5分後 上清を105000G60分し、沈殿を再度RIPAbufferで溶かしています。

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