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(無題) 削除/引用 No.2536-8 - 2008/12/30 (火) 04:06:23 - おお イントロンをCRE/LOXPで飛ばしてスプライシングが起こらないようにして ノックアウトさせる手法を好んで使う人がいますね。 たしか73ベース以下であれば起こらないというある実験(トロポマイシンだったと思う)を元にしていると思います。 エクソン1と2間のイントロンをそういうふうに極端に短くしてしまうというのは 可能かもしれません。 ESで確認実験はいるかもしれませんが、、、、

(無題) 削除/引用 No.2536-7 - 2008/12/29 (月) 21:14:26 - jazzmessenger プロモーターへの影響を避けるため、エクソン１ではなくエクソン２のノックアウトを考えていました。エクソン３はオルタナティブスプライシングがかかるため、イントロン２に影響が出てくるかもしれません。しかし、エクソン１から３のどれかをつぶさなければいけないので、どうしたものか悩みます。LoxPサイトまたはNeoカセットを入れたコンストラクトをIn vitroで発現させることも可能ですが、どこまでIn vivoで再現性があるものか心配です。エクソン１にしても２にしても、それなりにリスクがありそうですね。悩みます。。。

(無題) 削除/引用 No.2536-6 - 2008/12/24 (水) 09:05:05 - おお もう一つ思いついたのは、コンスティチューティブの場合は、イントロン 部位のスプライシングのシスエレメントに関する研究はあまりありません オルタナテティブスプライシングでは、イントロンを削っていくと、 スプライシングパターンが変化するので、そういった研究がおもです。 タブンコンスティチューティブなスプライシングがおこるイントロンであれば あまり気にしなくていいかもしれません。そういうエクソンはエクソン自身が スプライシング制御因子にアクセスしているか、スプライシングサイトが 典型的で、U1やU2snRNPのアクセスが保障されている場合が多いと思います。

ありがとうございました。 削除/引用 No.2536-5 - 2008/12/24 (水) 08:39:52 - jazzmessenger おおさん、 レスありがとうございました。エクソン直前、直後はかなり保存されていますが、離れたところのエンハンサー等はあまり保存されていないということでしょうか。ストレートなノックアウトのデザインは比較的楽でしたが、コンディショナルはなかなか難しいですね。。。

(無題) 削除/引用 No.2536-4 - 2008/12/22 (月) 17:13:26 - おお >[Re:3] jazzmessengerさんは書きました : > 「intronic splicing enhancer/silencer」を検索できるようなサイトをご存知でしょうか。 > 残念ながら、ないです。スプライシングサイトから2ー300ベースのところに よくスプライシングに必要な情報がのっていることが結構あるので、 スプライシングサイトから少なくとも500bp程度離すぐらいのこと しかいえません。強いていうなら、いま配列を持っていないですが、 hnRNPA1やfox1/2, Nova1/2といったスプライシングファクター 結合モチーフ、Gストレッチ、CUリッチ、トリプレットディジーズに 見られる繰り返し配列ににた配列などでしょうか。 まだほかにも候補があるかもしれませんが、、、今思い出せません。

(無題) 削除/引用 No.2536-3 - 2008/12/21 (日) 23:04:58 - jazzmessenger レスありがとうございました。 やはり最初のエクソンは避けた方が無難ですか。 他のエクソンを検討しようと思います。 「intronic splicing enhancer/silencer」を検索できるようなサイトをご存知でしょうか。 よろしくお願いします。

(無題) 削除/引用 No.2536-2 - 2008/12/21 (日) 07:28:09 - 君のハートにノックイン first exon をつぶすのは多少危険が伴いますね。 機能ドメインが知られているのであれば、そこをコードする exon をつぶした方がいいと思います。 さらにその exon の塩基数が３の倍数でなければベター。 intron が短ければ、point mutation で制限酵素サイトを作ってしまうという手もあります（やりやすい酵素サイトが作れるので、かなりベクター作りが楽になります）。 その際 intronic splicing enhancer/silencer のことも頭の片隅に入れておいた方がよいかもです。

コンディショナルノックアウト 削除/引用 No.2536-1 - 2008/12/21 (日) 00:16:11 - jazzmessenger ある遺伝子のコンディショナルノックアウトマウスを考えています。スタートコドンのあるエクソン１をLoxPで挟もうと考えているのですが、LoxPの挿入がプロモーターに与える影響が心配です。予想される転写因子等の配列は避けるように注意するつもりですが、それでも発現に影響がでるのではないかと悩んでいます。 他のエクソンも考慮にいれていますが、イントロンが比較的短く（1kb程度）、そこへLoxPサイトを挿入ｓるのも躊躇しております。さらに制限酵素のサイトの選択肢も限られてしまいます。 深く考え過ぎでしょうか。作成したコンストラクトをIn vitroで試験できる方法などありましたらご教示お願いします。

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