Bio Technical フォーラム

  • 書き込みがかなり増えてしまいサーバーの負荷が大きくなったので、新しいBioTechnicalフォーラムに移行してください。
  • 新しいトピックは新フォーラムでのみ立ち上げ可能です。レスは2009年2月15日までつけられますが、その後は、つけられません。

トピック一覧　|　研究留学ネットに戻る

最新のフォーラム　|　このフォーラム（readのみ）　|　ひとつ前のフォーラム（readのみ）

このスレッドをはてなブックマークに追加このスレッドをはてなブックマークに追加

抗体のアフィニティー精製 トピック削除
No.2731-TOPIC - 2009/01/26 (月) 18:49:41 - 抗体
以前こちらのフォーラムで、GST融合タンパク質を免疫して、MBP融合タンパク質で抗体を精製という方法が記載されておりました。
抗体作りを始めてまだ日が浅いので、この方法についてご教授願いたいのですが、GST融合タンパク質を免疫したウサギやモルモットの血清を直接（5倍希釈とかして）、NHS activatedなどのカラム（MBP融合タンパクを固相化済み）に通しても良いものなのでしょうか？
素人的にはやはり、硫安で粗精製して、Protein AカラムでIgGを精製してから、NHS activatedなど抗原カラムに通さなくてはいけないのでは？と考えるのですが、いきなり希釈した血清を通せれば、時間的にもコスト的にもずいぶん楽になるとも思います。
実際のところどうなんでしょうか？

あと、もう一点ご教授いただきたいのですが、抗原カラムで精製した抗体の抗体価が低い場合は、硫安で濃縮すれば多少はよくなるものでしょうか？
それとも1000倍とかに濃縮できないと10倍とか50倍とか濃縮ではあまり、改善は期待できませんでしょうか？

よろしくお願いいたします。
　
- このトピックにメッセージを投稿する -



全6件 ( 1 〜 6 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

(無題) 削除/引用
No.2731-6 - 2010/10/06 (水) 14:42:05 - よっしー
Protein Aでの事前精製はいらないと思いますが、硫安沈殿は補体を除く意味でもありかと思います。（精製カラムに抗体が付くと補体が抗体に付くため）硫安沈殿後はそのままPBSにでもとかしてカラムにかければいいので手間的には大したことは無いと思います。

(無題) 削除/引用
No.2731-5 - 2009/01/27 (火) 14:25:36 - EcoRI
あ、言葉がおかしいです

>濃縮したところで、単位総タンパク質量あたりに含まれる感度の高い抗体の量は変わらないわけです。
単位総タンパク質量、ではなくて、単位総抗体量、ですね

(無題) 削除/引用
No.2731-4 - 2009/01/27 (火) 13:40:36 - EcoRI
レスを付けてる間にちょっと考えがこんがらがってしまいました。
感度という言葉が、どのような意味を包括するのか、ということです。
「感度が高い」抗体とは、「非特異的な反応がなく、かつ、高い希釈倍率で使える」
ということだとすれば、濃縮はあまり意味が無いように思います。
つまり、濃縮したところで、単位総タンパク質量あたりに含まれる感度の高い抗体の量は変わらないわけです。

無意味とは言いませんが、あまりやりたくはないです。
変性しにくいと言われる硫安沈殿と言えど、全く変性しない保障はないですから。
アミコンなどの遠心式濃縮器でも、ロスがありますし。

抗原カラムでアフィニティー精製した抗体であれば、
理論上、そこには抗原に特異的な抗体しか含まれないわけですから、
単位総タンパク質量に含まれる感度の高い抗体は、精製前よりも多くなるので

>免疫したウサギのうち一匹はMBP融合タンパクに対するウェスタンで反応しなかったので、内因性のMBPは少ないと思います。
これは、何回か免疫した後のウサギの抗血清に対して、抗MBP抗体でWBしたということですか？
それならば、MBPカラムは必要ないでしょう。

(無題) 削除/引用
No.2731-3 - 2009/01/27 (火) 12:01:29 - 抗体
EcoRIさん
ありがとうございます。
免疫したウサギのうち一匹はMBP融合タンパクに対するウェスタンで反応しなかったので、内因性のMBPは少ないと思います。（抗体ができなかったことのほうが残念ですが・・・）

抗体の濃縮ですが、使用回数は減っても良いので感度を上げたいのですが、やはり無意味なのでしょうか？

また、抗原カラムで精製すると感度はあがると考えて良いのでしょうか？
単に非特異な反応が無くなるということだけでしょうか？

再度の質問になって恐縮ですが、お答えいただけますと嬉しいです。

(無題) 削除/引用
No.2731-2 - 2009/01/26 (月) 19:11:38 - EcoRI
タグが異なるタンパク質に対する抗体を精製しよう
というわけですね。

抗GST-<protein>抗血清をMBP-<protein>を固相化したカラムを通しても、
全く問題にならないはずです。
粗分画や粗精製などのステップを踏まずにできるはずです。
PBSなどでA280が0.01未満になるまでカラムを洗ったあと、溶出すれば、
通常は使える抗体ができるはずです。

ウサギとかラットの血清中にMBPに結合性を示す抗体があるかもしれませんから、
MBPだけを固相化したカラムが必要かもしれません。
でも、それはやってみないとわかりません。
精製抗体をWBに使うときに、pureなMBPをサンプルと一緒に流せば、MBP反応性抗体の有無がわかると思います。

抗体の濃縮についてですが、あまり意味はないと思います。
うまく言い表せませんが、濃縮したところで、抗体の"量"は変わらないので、
使える回数は結局一緒だと考えます。

抗体のアフィニティー精製 削除/引用
No.2731-1 - 2009/01/26 (月) 18:49:41 - 抗体
以前こちらのフォーラムで、GST融合タンパク質を免疫して、MBP融合タンパク質で抗体を精製という方法が記載されておりました。
抗体作りを始めてまだ日が浅いので、この方法についてご教授願いたいのですが、GST融合タンパク質を免疫したウサギやモルモットの血清を直接（5倍希釈とかして）、NHS activatedなどのカラム（MBP融合タンパクを固相化済み）に通しても良いものなのでしょうか？
素人的にはやはり、硫安で粗精製して、Protein AカラムでIgGを精製してから、NHS activatedなど抗原カラムに通さなくてはいけないのでは？と考えるのですが、いきなり希釈した血清を通せれば、時間的にもコスト的にもずいぶん楽になるとも思います。
実際のところどうなんでしょうか？

あと、もう一点ご教授いただきたいのですが、抗原カラムで精製した抗体の抗体価が低い場合は、硫安で濃縮すれば多少はよくなるものでしょうか？
それとも1000倍とかに濃縮できないと10倍とか50倍とか濃縮ではあまり、改善は期待できませんでしょうか？

よろしくお願いいたします。
全6件 ( 1 〜 6 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

パスワードを入力してチェックした記事を チェックした記事を