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ＬＣＭまでの時間 削除/引用 No.978-16 - 2008/04/29 (火) 15:34:01 - かよ ＬＣＭまでの時間は短ければ短いほどよいです。私は目安として４５分を過ぎるともうそのスライドは使いません。一枚５分くらいで採取できるなら、数枚を一度に処理することは可能だと思いますが、通常は一枚ずつ処理しています。ＲＮＡをきちんととるためには煩雑でも一枚ずつが無難じゃないかと思いますよ。 念のため、メールアドレスを書いておきました。 今後何かご質問がありましたらいつでもどうぞ。

(無題) 削除/引用 No.978-15 - 2008/04/29 (火) 01:19:40 - 塩基 すいません。最後にひとつ教えてください。 切片を複数枚ＬＣＭにかけるときに、脱水、キシレンとうてつ後にしばらく室温でおいておいてもよいものでしょうか？

ドライアイスです 削除/引用 No.978-14 - 2008/04/24 (木) 10:39:23 - かよ 氷じゃダメですね。後でＲＮＡをとるなら、ドライアイスの上に並べなければ。

(無題) 削除/引用 No.978-13 - 2008/04/23 (水) 23:10:29 - 塩基 細かいことで恐縮ですが、切った切片を‐80℃のフリーザに入れるまではどのようにされてますか？ 室温にならないように氷上で冷やしたりされてますか？

ＬＣＭの直前に 削除/引用 No.978-12 - 2008/04/23 (水) 22:11:28 - かよ わたしは切片を切ったら、そのまま（無固定のまま）、−８０度に保存しています。ＬＣＭをやる直前に７０％エタノール３０秒から始めてＨＥ染色しています。

(無題) 削除/引用 No.978-11 - 2008/04/23 (水) 09:05:00 - 塩基 ありがとうございます。 HEはしていません。染色の有無にかかわらず、切片作成したらスライドをすぐにエタノールで固定するという形でよろしいでしょうか

ＨＥ染色しますか？ 削除/引用 No.978-10 - 2008/04/23 (水) 08:59:00 - かよ 私は通常はＨＥ染色でＬＣＭをやりますので、無固定で凍結ブロックを作成し、染色の最初に７０％エタノール３０秒でやってます。

(無題) 削除/引用 No.978-9 - 2008/04/22 (火) 22:24:45 - 塩基 みなさんありがとうございました。 ついでにＬＣＭ関連のことでもう一つ教えていただきたいのですが、 組織を摘出しすぐにコンパウンドに包埋しクリオで切片を作成しています。 このあと何らかの固定はしたほうがよいのでしょうか？ ＰＦＡでは難しいと教えられ、70%エタノールやメタノール、もしくは固定なしで試してみようと思ってますが皆さんはどうなされてますか？

普通です 削除/引用 No.978-8 - 2008/04/22 (火) 09:19:18 - かよ ＬＣＭのサンプルでＲＮＡ濃度が測れないのはごく普通のことです。すでにかかれたように、バイオアナライザーがひとつの解決法ですが、そもそも、ＲＮＡの濃度が測れないくらいの微少サンプルが扱えることがＬＣＭの利点です。 ＬＣＭ後、もしリアルタイムＰＣＲをするのでしたら、そこで補正できますし、後は、サンプリング時にスポット数をそろえるという方法も使えます。たぶん、ＲＮＡ量で一桁もオーダーが違うと困ると思うんですが、同じスポット数でサンプリングすればそれほど大きな差になりません。 私は普段は採取した全量を用いてcDNAを合成し、そこから一定量をリアルタイムＰＣＲへ持って行きます。内部コントロールで４サイクルも違えば除いてしまいますが、通常はほぼサイクル数はそろっています。しかし、ターゲットがあまり発現していない遺伝子だと検出できない場合もあるでしょうね。その場合は採取する細胞数（スポット数）を増やすしかないかと思います。 ただし、１スポットに毎回同じ細胞数が入るわけでもないですから、もちろんこれは目安に過ぎません。しかしこの方法で論文を書いていますが、今まで問題にされたことはありません。

微量のとき 削除/引用 No.978-7 - 2008/04/21 (月) 20:28:06 - ema LCMサンプルが来たときは私はAgilentのバイオアナライザー2100でpico単位の検出をしています。 あと、デモで使っただけですがナノドロップの姉妹品でピコの測定ができるものも売られています。

(無題) 削除/引用 No.978-6 - 2008/04/17 (木) 20:48:07 - 塩基 ありがとうございます。確かにＬＣＭが一般的ですね。すいません。 一応吸光度は測定できないものの抽出したものを全量ＲＴしてＰＣＲするとこれまではだいたいＧＡＰＤＨのバンドが同じようになっていたのでなんとなく成功していたのですが、論文にＲＴしたＲＮＡ量などをかかなくてもよいのか気になったもので質問させていただきました。 ご意見があればお教えください。

(無題) 削除/引用 No.978-5 - 2008/04/17 (木) 20:42:39 - 失礼 ではlaser-capture microdissection = LCMの方が一般的ですね。 吸光度計で検出したいとすると最低でもA260=0.1で4ng/ulは必要でしょう。 私の扱っている細胞だと1x10e6細胞で約7マイクログラムのトータルRNAが取れますので、4ngだと600細胞分くらいです。抽出時のロス無し、切片の厚み（細胞の上下は少し削れてるかもしれませんよね）も無視したとして、これだけの細胞分のRNAを1ulに溶解してナノドロップで測定してようやく検出レンジに入ってきます、、、　要するに吸光度計で直接濃度を測定するのは大変じゃないかなと。特に切片数を稼げないときは。

(無題) 削除/引用 No.978-4 - 2008/04/17 (木) 20:00:52 - 塩基 すいません。レーザーマイクロダイセクションです。

(無題) 削除/引用 No.978-3 - 2008/04/17 (木) 14:59:03 - 失礼 大変申し訳ない。LMCとは何の略でどういう方法なのでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.978-2 - 2008/04/17 (木) 05:32:50 - おお ＬＭＣは使ったことがありませんので、それが一般的かどうか分かりませんが、微量の物を図るのであれば、プロメガがポリAーTail RNAを確かルシフェラーゼを用いてはかるキットを出してますし、蛍光色素を使うとUVより感度が上がると思います。

ＬＭＣ使用ＲＮＡ抽出時の濃度測定 削除/引用 No.978-1 - 2008/04/16 (水) 20:30:28 - 塩基 お世話になっております。 ある組織よりＬＭＣを使用してＲＮＡを抽出しようと思っています。 組織を打ち抜き、キャップで集めて、微量ＲＮＡ抽出カラムでＲＮＡを抽出しています。 このとき吸光度計で濃度を測定してますが検出限界以下になります。そこで全量をＲＴしてｃＤＮＡを作成してます。 質問なのですがＬＭＣ使用時は濃度測定できないのが通常なのでしょうか？ 微小な組織でありスライドの枚数を集めるのが難しいです。

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