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(無題) 削除/引用 No.1911-21 - 2008/09/18 (木) 12:42:50 - おお >[Re:18] qqさんは書きました : > SV-early promoter/ori付きのベクターとT抗原を発現する細胞の組み合わせだと、ステーブル取りのつもりで、エピソーマルにプラスミドをcarryした細胞を拾ってしまい、結局、細胞クローンが不安定になると、言う意味です。 私は染色体に取り込まれることにより、異常なレプリケーションが起きるのでよくないと聞きました、 >SV-promoterがoriなしになっていれば、この指摘はまったく当たらないわけです。 >[Re:19] ポーンさんは書きました : > いわゆるSV40プロモーター（SV40 earlyプロモーター）はoriとオーバーラップしているので、ori無しのSV40プロモーターって訳には行かないでしょう？違った？ テクニカルに問題ないですが、oriが必要というのを知らなければ、なぜダメなのか、何が起こりうるのか、どうやって利用しているのかなど理解できないままの人が出てこないかと心配したわけです。

(無題) 削除/引用 No.1911-19 - 2008/09/18 (木) 12:02:40 - ポーン いわゆるSV40プロモーター（SV40 earlyプロモーター）はoriとオーバーラップしているので、ori無しのSV40プロモーターって訳には行かないでしょう？違った？

(無題) 削除/引用 No.1911-18 - 2008/09/18 (木) 11:17:21 - qq SV-early promoter/ori付きのベクターとT抗原を発現する細胞の組み合わせだと、ステーブル取りのつもりで、エピソーマルにプラスミドをcarryした細胞を拾ってしまい、結局、細胞クローンが不安定になると、言う意味です。逆に、Long-transientとでも言ったような考え方で、この組み合わせは、現実的かもしれません。SV-promoterがoriなしになっていれば、この指摘はまったく当たらないわけです。

(無題) 削除/引用 No.1911-17 - 2008/09/18 (木) 02:11:53 - おお >[Re:16] qqさんは書きました : > それとも、T抗原などで、不死化してあるのでしょうか？T抗原があると、SVプロモータ付きのベクタですテーブル取りは、難しそうですね。だから、293Tはだめです。 SVプロモータ付き この表現は誤解を招きませんか?

(無題) 削除/引用 No.1911-16 - 2008/09/18 (木) 00:00:12 - qq ヒト線維芽細胞（初代培養細胞）とありますが、寿命があると考えてよろしいですか？ ヒトから初代を取るのがどの程度難しいのか分からないのですが、20回程度の分裂寿命（単純に10^6細胞ですね）が残っていないと、クローン化の途中で老化して増殖停止する可能性もあるかもしれませんよね。得に増殖しない細胞はG418に耐性ですから、一見G418耐性のように見えても、実はNeoが入っていないことすらあるかもしれません。不安だったら、GFPかNeoのゲノムPCRで確認しても良いかもしれません。 あなたのターゲット細胞とは別にもっと簡単なヒト由来細胞（HEK293とか）で、並行してやってみてもよいかもしれません。 それとも、T抗原などで、不死化してあるのでしょうか？T抗原があると、SVプロモータ付きのベクタですテーブル取りは、難しそうですね。だから、293Tはだめです。 最後のクローン拾いのことを考えると、フラスコではなく、10-cm dishでセレクションすることをお勧め致します。 あと、トランスフェクションの2dayでは、もちろん、10%以上は光るのですよね？

CMVについて 削除/引用 No.1911-15 - 2008/09/17 (水) 20:41:11 - アルファ みなさんの意見を聞いて、改めて自分のもつベクターを調べてみました。　すると、CMV-GFP tagged-Target geneとSV40-Neoでした。　抗生剤選択培地下で増殖するにも関わらずGFPがほとんど確認できないということは、この細胞ではCMVよりSV40のほうが強いのかもしれません。 IRESについても前向きに考えてみます。

(無題) 削除/引用 No.1911-14 - 2008/09/16 (火) 08:28:03 - おお >[Re:13] 染めQさんは書きました : > いまさらですが、私ならこうするというのを挙げます。 > > Kさん　の言われるようにIRESを用いたベクター IRES-GFPよりIRES-neoとかの方がいいような気がしてます。 IRES-GFPはフュージョンとおなじように、遺伝子が細胞の増殖に影響を与えている時はIRES-GFPのユニットが効率的に発現していないクローンしかふえないような気がしますから

(無題) 削除/引用 No.1911-13 - 2008/09/15 (月) 15:55:14 - 染めQ いまさらですが、私ならこうするというのを挙げます。 Kさん　の言われるようにIRESを用いたベクターを用いて最新のトランスフェクション試薬を試す。Lipofectamin LTX, FuGene HD, NanoJuiceなど。 これらは高価なので全部タダのサンプル品をもらう。 いまサンプルとしてもらえるのはNanoJuiceのみ？？ atsさん　の言われるようにCMVは私も避けると思います。EF1＋IRES＋Puroを使うかな。

ありがとうございました 削除/引用 No.1911-12 - 2008/09/11 (木) 19:27:34 - アルファ まずは、直鎖状を使ってelectroporationを試してみます。　皆さんのアドバスのおかげで、まだはっきり原因はわかりませんが、いろいろと道が開けたと思います。 いろいろと分からないことだらけですので、またアドバイスをお願いします。

(無題) 削除/引用 No.1911-11 - 2008/09/10 (水) 03:43:08 - おお >[Re:10] アルファさんは書きました : > 今までは直鎖状でないプラスミドを用いてリポフェクションを何も疑わずに >してました。　テキストを見てみると、electroporationでstable >transfectionを行う場合はリニアにすべきとの記載がありました。　 直鎖にするのは必須ではないです。比べてみてもいいかなというぐらいです。エレクトロポレーションは直鎖でやることも多いようですね。ESだとかだとコピー数のコントロールもしやすいようです。直鎖にした方が発現ユニットを損ないにくいだろうというのはそうですが、取れてきたクローンそれぞれについてそうかは当てはまらない可能せいもありますので、環状と同様の注意が必要です。 > > 何回も質問申し訳ないですが、誘導発現系とはTet-onやCre/loxPなどのこと >でしょうか？ Tet-on/offはよく使われていますね。古典的にはステロイド(dexamethasone)で誘導できるMMTVや、重金属で誘導できるものがあったと思います。然しながら細胞の影響が少なからずでますので、それを改善したものの一つがTetのシステムです。少し昔に昆虫のホルモン(Ecdysoneだったとおもう)を使った哺乳動物用誘導型プロモーターのリーフレットを見たような気がします。そのほかこれは売っているかどうか分かりませんがIPTGをつかう哺乳動物用誘導型プロモーターを文献で見たことがあります。 これらの誘導型のプロモーターは多かれ少なかれリーキーだといわれます。tetのシステムはよくできていてタイトであると言われますが、それでもリークは否定できない面があります。 Cre-LoxPのシステムは染色体の配列を切り出したりして発現などを制御しますので、設計の仕方次第ではタイトと言えると思いますが、Creを再度トランスフェクションしてとなるとその時の発現効率が問題になります。CreをTetで誘導というてもあるかもしれませんが、細胞レベルでそこまで手の混んだことしないといけないかなという気がします。

勉強になりました 削除/引用 No.1911-10 - 2008/09/09 (火) 20:49:21 - アルファ 「おお」さん「K」さんの丁寧な解説とても勉強になりました。　クローナルバリエーションについても理解できました。 今までは直鎖状でないプラスミドを用いてリポフェクションを何も疑わずにしてました。　テキストを見てみると、electroporationでstable transfectionを行う場合はリニアにすべきとの記載がありました。　理由はお二人が言った通りだと思います。　とても勉強になりました。　早速electroporationの準備をします。　別の種類でGFPを含むベクターも併せてやってみます。 何回も質問申し訳ないですが、誘導発現系とはTet-onやCre/loxPなどのことでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.1911-9 - 2008/09/09 (火) 11:26:31 - K plasmidの導入によるstable cell lineを作成する際にはplasmidに含まれる領域のうち、目的の遺伝子が発現する領域と薬剤耐性遺伝子が発現する領域の両方が正確にゲノムに組み込まれることが必要です。 直鎖化していないplasmidを導入すると、細胞内でランダムに切断されたものが組み込まれることになります。そのときに目的の遺伝子の発現に影響するような領域が切れてしまうと、薬剤耐性は持っていても目的の遺伝子を発現しないようなクローンが出現する可能性が高くなります。直鎖化していてもそのようなクローンは出現するので注意が必要です。 また両方の遺伝子が正確に発現するように組み込まれていても別々のプロモーターから発現しているため、目的の遺伝子のプロモーターが特異的にサイレンシングされてしまい、薬剤耐性のみを獲得してしまうこともあります。目的の遺伝子が培養条件下の細胞増殖に不利な場合にはその傾向がより出てきます。 ウイルスを使わずに、薬剤耐性クローン＝目的の遺伝子を発現しているクローンである確率を上げるには他の方のアドバイスにもあるように目的の遺伝子と薬剤耐性遺伝子をIRESでつないで発現させることだと思います。 IRESを用いてもクローンが取得できない場合は対象の遺伝子に致死性があると思われるので誘導発現系を構築することをおすすめします。

(無題) 削除/引用 No.1911-8 - 2008/09/09 (火) 11:09:23 - おお >[Re:7] アルファさんは書きました : > 皆様早速のアドバイス有難うございました。　 > > お恥ずかしい話ですが、Mockを作製する為の組み換えが上手くいかずに見切り発車した状態です（他のラボからもらったコンストラクトなのと、しかもpEGFP-C3は生産中止なもので）ので、 GFPのようなものを発現するベクターをおもちでないでしょうか。 導入効率は参考のため見ておきたいですし。 > タンパクの毒性などに関しては否定できません。　文献的には増殖を抑制（分化を促進）する可能性があります。　基本に忠実にやります。 ある遺伝子の安定導入株を作ることを試みたポスドクが、どうしても取れなかったことからがん抑制遺伝子である可能せいを考えて、その後それを証明したという話を聞いたことがあります。安定導入株で発現されるのが難しい遺伝子は意外とあると思っています。 以前私が使っていた遺伝子は、全滅でした。導入直後はかなりが光っていたんですがセレクションをかけると光ったクローンは全然取れないという状況でした。増殖抑制は、細胞死に関係ある遺伝子でした。今使っているものもだめっぽいです。 > > ところで、クローナルバリエーションというのは何でしょうか？　 原因になる因子が2種類あると思います。特に株化細胞では一つ一つの細胞をみると、それそれ性質が異なります、ですからシングルクローンから得られる細胞はクローン間で性質がことなる可能性があります。 もう一つの要因は導入した遺伝子が染色体にランダムに入り込むことを考えると、それぞれのクローンで違うわけです。それだけならまだいいのですが、なかにはコーディングリージョンがほかの遺伝子と融合していたり、あまりにも増殖にネガティブに働くために、導入したプラスミドに変異が入ったりして見かけ上発現していても、遺伝子の機能が損なわれていたりということもありえます。 増殖などに負に働く遺伝子に限らず大抵複数のクローンをとって、遺伝子の導入で同じような傾向が見られるかとか、その遺伝子による作用が各クローンの発現量と相関しているかなどみておかないと、特殊なクローンをたまたま拾っただけじゃないかと疑われる可能性があります。 > > ＞plasmidは直鎖状にして導入しているという前提で、。。。 > 相同性組み換えではないのですがリニアにするのでしょうか？　すみません無知なもので、、、、、 この件に関しては回答者本人ではないですが、直鎖にすることで、ゲノムに組み込まれる頻度を可也上げれる場合があります。

お礼 削除/引用 No.1911-7 - 2008/09/08 (月) 21:02:13 - アルファ 皆様早速のアドバイス有難うございました。　 お恥ずかしい話ですが、Mockを作製する為の組み換えが上手くいかずに見切り発車した状態です（他のラボからもらったコンストラクトなのと、しかもpEGFP-C3は生産中止なもので）ので、タンパクの毒性などに関しては否定できません。　文献的には増殖を抑制（分化を促進）する可能性があります。　基本に忠実にやります。 先ほどもコロニーのGFPを見に行きましたが、真っ暗でした。　「~」さんが書かれたとおりトランスフェクション効率を気にせず、最初はマスカルチャーで使い物になるかと思ってましたが、あまりにも真っ暗なので、諦めてクローン化を始めたところです。　一応、いくつかのウェルにGFP陽性細胞が今はいます。　ところで、クローナルバリエーションというのは何でしょうか？　 ＞plasmidは直鎖状にして導入しているという前提で、。。。 相同性組み換えではないのですがリニアにするのでしょうか？　すみません無知なもので、、、、、 やはりレトロでしょうかねー。　別のpromoterの選択も含めて検討してみます。

(無題) 削除/引用 No.1911-6 - 2008/09/08 (月) 14:28:58 - おお >[Re:5] -さんは書きました : > 初代培養細胞だと、やはりレトロかレンチでIRESの下流に耐性遺伝子を含むコンストラクトを使うのがベストでは？ IRESもアドバイスの一つとして考えたんですけどね。でもタンパクの分解が早いとかが原因で、GFPは光っているけど目的のタンパク弱すぎて使い物にならない可能性がないかと、、、、

(無題) 削除/引用 No.1911-5 - 2008/09/08 (月) 11:55:54 - - 初代培養細胞だと、やはりレトロかレンチでIRESの下流に耐性遺伝子を含むコンストラクトを使うのがベストでは？

(無題) 削除/引用 No.1911-4 - 2008/09/08 (月) 09:38:56 - ats plasmidは直鎖状にして導入しているという前提で、。。。 (1)BESを用いたCa-PO4法も線維芽細胞なら導入法として比較的よい結果が得られると思います。 (2)薬剤耐性遺伝子をpuromycin耐性やblasticidinS耐性に変えても非導入細胞が2-4日で死滅するので結果が早く得られます。 (3)研究上の問題は不明ですが、初代培養細胞だと寿命がありますので、やはり導入細胞が容易に素早く得られるレトロウィルスをおすすめします。最近の主流のself-inactivating virusがよいでしょう。 (4)初代培養細胞だとpEGFP-C3のCMV promoterは、不活化されやすいかも知れません。 EFa promoterを使えば、エンハンサーの影響も排除できます。 (5)おおさんが述べているように発現誘導タイプもおススメです。 実際、ある遺伝子の機能を調べている過程で既報のtransient expression系やstable expression系とは異なる結果が得られ、原因の解釈が厄介なのですが現在解析を進めているところです。

(無題) 削除/引用 No.1911-3 - 2008/09/08 (月) 09:24:53 - ~ pEGFP-C3単独での結果によって、方針が変わってくると思いますが。 TIG7だと、リン酸カルシウム法でtransientには10%以上入っていたと記憶しています。 安定発現株と書かれていますので、マスカルチャーではなく、クローンを取ろうとしているのですよね。 シングルクローンを取るのであれば、1%入れば何とかなるような気がしますが。 Stableで10^4~6に1個くらい取れれば使い物になりますよね。 今回も、少なくとも薬剤耐性が見られていないというわけでもありませんし、 トランスフェクション効率を気にする必要は無い気がしますが。 セレクションをかけるときには、同じ細胞数で親株をネガコンとして撒いておくと、生えてきた細胞が耐性かどうかの目安になるかと思います。 G418は細胞数の影響を受けやすい印象があります。 それと、同じプレートで3週間は待ちすぎていませんか？ その株の倍加時間は分かりませんが、1日1回分裂だとすると、1コロニーが2^21個の細胞になってしまいます。 10日くらいでペニシリンキャップなどで単離して、96wellプレートなどに移すことで、より強いセレクションがかけられるでしょう。 (このときの薬剤濃度も検討が必要でしょう) せっかくpEGFP-C3で融合タンパク質を使っているのですから、 もし、近所にFACSがあるのでしたら、それで単離することで、GFPの発現の強い細胞を単離することもできるでしょう。

(無題) 削除/引用 No.1911-2 - 2008/09/08 (月) 04:43:18 - おお 選択の過程でコロニーは形成されますでしょうか?できないならG418が効いていないかも、、、とおもいましたがそうでもないかもしれませんね。 まずタンパクによっては発現させるのが難しい場合があります。その遺伝子が直接または間接的に細胞周期や細胞死、分化に関与するものならその可能性が高いと思います。こう言うばあい目的の遺伝子が発現している細胞は増えなかったりするため、増えてくる細胞は目的の遺伝子の発現がほどんどない細胞だったりします。 それでも何とか試行錯誤で発現しているコロニーを拾う人はいますが、クローナルバリエーションなどを考えるとはたして良い方法か分かりません。 もし可能でしたら誘導型の物を作るとかが考えられます。 そういう観点から導入効率が悪いのも、導入効率だけの問題か、そのタンパクの半減期の問題も考慮に入れないといけないのかという点が気になるところです。コントロールとして、その遺伝子を入れてないベクターを使われましたでしょうか? 試薬でベストの物というのであれば、これは相性の上に手技、環境などいろいろなファクターが加わりますので、たのラボでよかったものが、あなたのラボでうまく行くかは分かりませんが、fugene 6あたりはよいとよく聞きます。

Stable transfectantの作成について 削除/引用 No.1911-1 - 2008/09/07 (日) 21:39:02 - アルファ 　ヒト線維芽細胞（初代培養細胞）を用いた安定発現株の作製で困ってます。発現ベクターはpEGFP-C3を用いてます（研究のデザイン上できればウイルスは避けたいと考えてます）。6穴もしくはT75で10%FCS含有αMEMで培養してます。アドバイス頂ければ助かります。 １．様々なlipofection試薬、electroporationやHJV Envelopeベクターなど試しましたが、導入効率は1%程度です。他に効率の良い方法があれば教えてください。 ２．トランスフェクション48時間後、G418選択培地（正常細胞が一週間程で全滅する濃度で、三日から四日ごとに培地を交換）で培養を始めて三週間程経ってGFPを顕微鏡で確認すると、99%以上がGFP発現のない正常細胞ばかりです。細胞密度が増すと正常細胞へG418が効きにくくなるか、一部の導入細胞の発現ベクターが何らか排出されたかとも思いますが、あまりにも発現細胞が少なすぎます。どうすれば発現細胞の割合を増やすことができるのでしょうか？ 長々と書きましたが、是非宜しくお願いします。

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