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(無題) 削除/引用 No.2455-7 - 2008/12/09 (火) 19:55:28 - よっしー 僕は細胞をはがす時，55cm2 (10cm dish)に3mLのトリプシン/EDTAを加えて はがしてます． 75cm2で0.5mLではおおさんのおっしゃるとおり，細胞が乾燥してませんか？

(無題) 削除/引用 No.2455-6 - 2008/12/08 (月) 20:24:41 - たむら >[Re:4] ~さんは書きました : > >コンフルエントに達したら継代しようとすると > コンフルエントに達する前に継代する細胞は多いと思いますけど、 > お使いの細胞はコンフルエントにしてもいい細胞ですか？ コンフルエントにしても大丈夫な細胞だと思います。 > 少な目の細胞数のときにトリプシン処理するとどうなりますか？ 少なめの細胞数でも同じような現象が起こりました。 > Dishのサイズが分かりませんが、300uLは少ないですね。 > もっと入れたらどうなりますか？ 75 cm2のフラスコを使っています。 トリプシンEDTAはどの程度入れるべきでしょうか？ 500 uLを加えてみたことはあるのですが、変化はありませんでした。

(無題) 削除/引用 No.2455-5 - 2008/12/08 (月) 20:16:37 - たむら >[Re:3] おおさんは書きました : > で、けいだい後の細胞の調子はどうでしょうか、、 継代後は細胞が増殖しないです。 > トレパンブルーは使っていないので使ってみたいと思います。 > あとは、、、単純に部分的に乾いているという ことはないでしょうか、、、、 部分的に乾いているというのはどの段階でのことでしょうか？ おそらく乾いていることはないと思います。

(無題) 削除/引用 No.2455-4 - 2008/12/08 (月) 17:58:52 - ~ >コンフルエントに達したら継代しようとすると コンフルエントに達する前に継代する細胞は多いと思いますけど、 お使いの細胞はコンフルエントにしてもいい細胞ですか？ 増えすぎると、細胞が凝集しやすくなる場合もあります。 少な目の細胞数のときにトリプシン処理するとどうなりますか？ その細胞ではどうか知りませんが、 培地を入れる前に、トリプシンだけでピペッティングすると、 よくほぐれる場合があります。 弱い細胞だとダメージを受けますけど。 Dishのサイズが分かりませんが、300uLは少ないですね。 もっと入れたらどうなりますか？

(無題) 削除/引用 No.2455-3 - 2008/12/08 (月) 17:07:49 - おお で、けいだい後の細胞の調子はどうでしょうか、、 トリプシン処理がきつすぎても(ながすぎても)細胞が 繊維みたいに絡まったようになってあぐります。 プロトコールだけで判断するとそれはあまり 考えられませんが、、、トレパンブルーなどを 使ってますでしょうか? 細胞の調子がある程度判断できますので、 何が起こっているのかの、ヒントになると思います。 あとは、、、単純に部分的に乾いているという ことはないでしょうか、、、、

(無題) 削除/引用 No.2455-2 - 2008/12/08 (月) 15:14:29 - ~ 細胞や血清を疑う前に、まずは操作だと思います。 トリプシン処理の時間を長くすることで改善するかもしれません。 これで改善するのであれば、トリプシンが古くなって失活しているのかもしれません。 Fibroblastだとトリプシン処理が短いためにアグるというのは良くあるのですが、 sarcomaでどうなのかは分かりません。 すくなくともSaos-2で起きたのを見たことがありません。

S-180細胞の継代 削除/引用 No.2455-1 - 2008/12/08 (月) 14:57:28 - たむら sarcoma S-180細胞を凍結から起こしコンフルエントに達したら継代しようとすると細胞が目で見てわかるほど白く凝集してしまいます。 以前は同じ操作で普通に継代できていたのですが、 これは細胞がおかしくなっているのでしょうか？ それとも操作に問題があるのでしょうか？ 下に操作手順を示します。 1、培地を除去し、PBS(5 mL)で2回洗浄する。 2、0.05% トリプシンEDTA(300 μL)を加え、2分間37℃でインキュベーショ ンする。 3、培地(5 mL)を加え、ピペッティングし、数を数え継代する。 　(ここで培地を加えると白い塊が浮いてきます。) この白い塊はピペッティングすることである程度バラバラにすることができるのですが、細胞を数えてみると明らかに数が少ないです。 何かありましたら教えてください。お願いします。

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