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(無題) 削除/引用 No.2580-10 - 2009/01/03 (土) 05:08:46 - あべちゃん 手を動かす前に、調べる。 羊土社の実験医学プロトコール特集（別冊）などに日本語で丁寧に説明されている本があります。もしも、学生の方ならば、図書館に実験医学は所蔵されている可能性は高いでしょう。（なければ、図書館のサービスでコピーを取り寄せる事もできます） それをよく読むことをお勧めします。というのも、多少、基本的な認識不足を感じるので。 僕も、先走って実験し、あとあと、「あっ、こうすればよかったのか」と時間の無駄遣いをよくしました。 このフォーラムでは親切に教えてくださる方もたくさんいますが、それでも、査読を繰り返したプロトコール集のような書物になった情報には、かないません。

(無題) 削除/引用 No.2580-9 - 2009/01/02 (金) 08:02:00 - 初心者 みなさん、ありがとうございます。 予定としてはnon-RIで予定しています。 ラベルとしては、gDNAをテンプレートとしてDIGかビオチンでラベルしたprimerを用いてPCRをおこない、得られたPCR産物をプローブとしてゲルシフトアッセイに用いようと考えています。 ラベルをどちらにするか検討中ですが、DIGかビオチンのどちらがいいのでしょうか? もしくは、他に好ましいラベル（ＲＩ以外）はあるのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.2580-8 - 2009/01/01 (木) 03:31:13 - カナマイシン DIGのTdTシステムは、たまに使いますが特に問題ないです。 labeled probeが1 種類しか必要ないのであれば DIGラベルされたプライマーを注文してそれで増幅してしまえばいいでしょうでし、 複数種必要なのであればTdTの試薬を買った方が安くつくのではないでしょうか。 コストを検討したことはないです。誰か教えていただければ幸いです。 個人的にはやっぱりRIラベルが一番手軽です。 所属施設のRIの使いやすさにもよると思いますが… 長さについてはロシュのDIGゲルシフトキットでは100 bp以下を推奨してます（確か）。 経験上、400くらいなら泳動条件の検討次第で問題なくできてます。

(無題) 削除/引用 No.2580-7 - 2008/12/31 (水) 19:02:12 - AP RocheからDIGのシステムがでています。 末端ラベルはTdT (terminal deoxyrbonucleotide transferase)でDIG-dideoxy-dUTPを末端に付加（ddUTPなので複数塩基のtailingではなく一個だけ付加される）する方法が採用されています。うちでやったときはそれを使わずに、5'末端DIGラベルでオーダーしたプライマーでPCRをかけた産物をプライマーにしました。 内部ラベル法ではプローブの分子量が変わってしまい、しかも一定しませんし、ハプテンラベルがタンパク質との結合に影響を与えますから不適当です。

(無題) 削除/引用 No.2580-4 - 2008/12/31 (水) 17:21:25 - おお キットで済ませるとお考えなら、ピアス辺とかそれ用にだしてますが、、、 DIG末端らべるのプロダクトシートを見たことがあるようなきがします。 使う大きさはどれくらいでしょうか、、、 あまり大きいとシフトさせるのは厳しいと思います。PCRはラベル効率として 可能な選択肢なのかちょっと分かりません。ただこのてのラベルキットは いろいろ種類がでまわっていると思いますので、探せばすぐ見つかると おもいます。ロッシュ、GEにもありそうな気がします。 Non-RIでお考えですよね、、、、

勘違い 削除/引用 No.2580-3 - 2008/12/31 (水) 16:59:19 - 初心者 ＞おおさん ご指摘ありがとうございます。 完全にゲルシフトの原理を勘違いしていました。 タンパクで比較すると、シフトがはっきりと見えませんよね・・・ 追加での質問なのですが、実験系として、細胞からプロモータ領域のＤＮＡ鎖を抽出し、これをプローブとして用いたいと考えていますが、 ＰＣＲなどで増幅させたＤＮＡ鎖にラベルするキットなどはあるのでしょうか？ それとも、シークエンスを確認した上で外注などでラベルしてもらう必要があるのでしょうか？ もしよければ、教えてください。

(無題) 削除/引用 No.2580-2 - 2008/12/30 (火) 10:41:37 - おお >[Re:1] 初心者さんは書きました : > 皆様こんにちは。 > 変性ゲルを使うと、DNAや結合が分解されてしまうのでしょうか？ 変性ゲルとはどんなゲルを考えているのでしょうか。 ウレア入りですか?いずれにしろタンパクが変性して従来の生理的な 活性が失われてしまいます。 > > あと、ゲルの違いは別にして、手順を通常のウエスタンブロッティングと同じようには出来ないのでしょうか？ > つまり、DNA断片と抽出タンパク（転写因子）をアニーリング処理 > 　　　　処理産物をサンプルとして電気泳動およびメンブレンに転写 > 　　　　転写因子特異的一次抗体とインキュベート > 　　　　HRP結合２次抗体でインキュベート後に検出 > を考えていますが、この方法だと無理なのでしょうか？スーパーシフトが見えないのでしょうか？ 物によると思いますけどたんぱく質の 動きはそんない大きくないのではと 思います。 ちいさいDNAが移動度が速いのを利用して、タンパクにトラップされた時 比較的移動度が少ないタンパクと挙動をともにするのを 見る方法だとおもいます。 タンパクの検出はやってもいいかもしれませんが、普通あまりやりません。

ゲルシフトアッセイ 削除/引用 No.2580-1 - 2008/12/30 (火) 10:29:02 - 初心者 皆様こんにちは。 来年に入ってからですが、ゲルシフトアッセイにて転写因子のDNA結合能の違いを検討する予定です。 プロトコールなどを検討していて、ふと疑問に思ったことがあったので今回質問しています。 いくつかのプロトコールでは、ゲルシフトアッセイは非変性アクリルアミドゲルを用いることになっていますが、その理由があまり理解できません。 変性ゲルを使うと、DNAや結合が分解されてしまうのでしょうか？ あと、ゲルの違いは別にして、手順を通常のウエスタンブロッティングと同じようには出来ないのでしょうか？ つまり、DNA断片と抽出タンパク（転写因子）をアニーリング処理 　　　　処理産物をサンプルとして電気泳動およびメンブレンに転写 　　　　転写因子特異的一次抗体とインキュベート 　　　　HRP結合２次抗体でインキュベート後に検出 を考えていますが、この方法だと無理なのでしょうか？スーパーシフトが見えないのでしょうか？ 初心者の質問で申し訳ないのですが、もし、教えていただけるのであれば、お願いします。

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