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(無題) 削除/引用 No.2670-9 - 2009/01/24 (土) 10:37:08 - おお >[Re:8] ３Ｇさんは書きました : > 乾燥についての体験談でないので恐縮ですが、 > ポリビニルピロリドンでのブロックはかなり優秀と認識しています。 > よく３％くらいのミルクを使っていますが、ビオチンとか検出するときは > 代わりに３％ポリビニルピロリドンにしています。バックは無いです。 ありがとうございます。PVPはたまに使います。 どうもミルクでやるより検出感度がおちます。 たぶん抗体量を増やせばいいかと思いますが、 現在のところPVPでやる理由はないので、ミルク をつかってます。PVPだとミルクみたいにヨーグルト にはならないので、大量作りおきでもいいでしょうね。 PVPとPEGとかのミックスを使うプロトコール も見かけたような気がします。 ビオチンは確かにミルクはやめた方がいいですね。 3%は多いような気がしますが、ビオチンのばあいは そんなもんなんでしょうか、、、

(無題) 削除/引用 No.2670-8 - 2009/01/24 (土) 10:12:40 - ３Ｇ 乾燥についての体験談でないので恐縮ですが、 ポリビニルピロリドンでのブロックはかなり優秀と認識しています。 よく３％くらいのミルクを使っていますが、ビオチンとか検出するときは 代わりに３％ポリビニルピロリドンにしています。バックは無いです。

(無題) 削除/引用 No.2670-7 - 2009/01/24 (土) 08:24:48 - おお >[Re:6] しょさんは書きました : > もう遅くなってしまいましたが、経験があります。 > 結果としては、シグナル強度はそのままで、いつもよりもバックグラウンドが増えましたので、以降行っていません。 全然遅いとかなく、大丈夫ですよ。 バック上がっちゃいましたか、、、、 抗体とか、やり方によるんでしょうねきっと。 ブロッキングは確かにミルクは安いでしょうけど、 事情がありBSAとか使っているとかありますからね。 あと、抗体で染まった部分をマスに持っていく ため抗体をはがしてから、バンドの出た部分から ペプチドを得るとき、タンパク成分によるブロッキング はできませんから、、、 とにかく、ご経験を聞かせてくださって、 ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.2670-6 - 2009/01/23 (金) 20:47:51 - しょ もう遅くなってしまいましたが、経験があります。 結果としては、シグナル強度はそのままで、いつもよりもバックグラウンドが増えましたので、以降行っていません。 別の研究室の方で、日常的にブロッキングなしで乾燥させている人がいるのですが、その人は上手くいっているみたいです。その人曰く、「乾燥させると、長期間保存がし易い、また、乾燥と同時にメンブレンに埋もれていたタンパクが表面に出てくる（本当かな？？）ため、感度が上がる」だそうです。 洗いの回数や抗体反応の条件を検討すればそれなりに使えるのではないでしょうか？？ 広まっていない理由は、そもそもブロッキング剤くらい、皆ケチらないからではないでしょうか？？

(無題) 削除/引用 No.2670-5 - 2009/01/18 (日) 13:13:36 - おお >[Re:4] ｙｔさんは書きました : > ＰＶＤＦ乾燥「のみ」と言うのはやったことはありませんが、ミルクでブロッキングをした後に十分乾燥させた方がバックグラウンドが低くなるような傾向があったので、いつもそうしてました。 > と言っても、乾燥させたものとしてないものとで改めて比べたことはなくて、元々背景のそれ程高くない良質な抗体だったので、実際どの程度効果があったかは何ともいえません。 > あくまでも、「印象」程度の話です。 ありがとうございます。ブロッキングご乾燥ですか。 以前ニトロセルロスですが、ブロッキングの時に、 バッファーが知らない間にこぼれてしまっていて、 乾燥してしまったことがあります。その時は 抗体が反応しませんでした。 抗体次第なんでしょうね。

(無題) 削除/引用 No.2670-4 - 2009/01/18 (日) 11:42:04 - ｙｔ ＰＶＤＦ乾燥「のみ」と言うのはやったことはありませんが、ミルクでブロッキングをした後に十分乾燥させた方がバックグラウンドが低くなるような傾向があったので、いつもそうしてました。 と言っても、乾燥させたものとしてないものとで改めて比べたことはなくて、元々背景のそれ程高くない良質な抗体だったので、実際どの程度効果があったかは何ともいえません。 あくまでも、「印象」程度の話です。

(無題) 削除/引用 No.2670-3 - 2009/01/18 (日) 11:39:46 - おお >[Re:2] たいあさんは書きました : > 時間もお金も節約できるのにそれほど > 広まっていないということはなにか不利な理由があるのでは？ ありがとうございました。ご指摘の辺を勘ぐっています。 １度乾燥させたあと、バッファーを加えてすぐにできないので 放置しておいたら、徐々にバッファーが浸透してきて、、、 結局は普通にウエスタンしたことがあります。

(無題) 削除/引用 No.2670-2 - 2009/01/18 (日) 10:28:55 - たいあ 一度だけ経験があります。 再現性をとっていないので、本当にそうなのかは わかりませんが、その時の感触を。 普段は3% BSAでブロッキングしています。 乾燥させる方法は、感度はまずまずですが、 BSAに劣るかなと感じました。 リプローブして他の抗体でも見たんですが、 いつもよりノンスペが多かったように感じました。 あくまでも一度だけの使用感です。 試薬を使ってブロッキングする方法に比べて 時間もお金も節約できるのにそれほど 広まっていないということはなにか不利な理由があるのでは？

PVDFをトランスファー後乾燥 削除/引用 No.2670-1 - 2009/01/18 (日) 07:51:02 - おお ミリポアのホームページだったとおもいますが、 PVDFをトランスファー後乾燥 する方法が紹介されているようです。 彼らの理屈では、乾燥させてその状態で 抗体に反応させると、タンパクがトランスファー されていない部分は水を弾くので抗体が アクセスせずバックグランドがでないと いうことです。逆にタンパクのあるところは 膜よりも親水性があり、抗体がアクセスできる のでバンドの検出が可能であるというようなことが 書いています。 どなたか試された方いますでしょうか? 検出感度とか、実際のところが気になります。

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