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(無題) 削除/引用 No.2723-6 - 2009/01/25 (日) 08:15:36 - おお >[Re:5] 酸性さんは書きました : > GSTフュージョンでも起こりますが、C末からの長さの違ったデリーションのような感じの産物が得られることがあります。真核細胞では大腸菌細胞とはメカニズムは微妙に違うかも知れませんが、 従来発現している生物の細胞に入れているのであれば、 分解の機構は全く違うことは容易に想像できます。 まえのコメントで申し上げたように発現制御のための 分解が起こっている可能せいです。 > > 293Tでも経験があります。とくに発現が困難で、分解され安い蛋白に多いような気がします。 N末にタグをいれたリコンビナント(N末だけに限って起きるわけではないですが) 分解産物、または翻訳が途中でとまったと思われる産物がよく見られますね。 大腸菌に悪さをしている可能性のあるたんぱく質とか、あまり効率よく 全長が発現せず、GSTなどのタグの部分とほぼ同じ大きさのタンパクばかりが 見られる場合があります。 同様にマンマルの細胞でマンマルの遺伝子にコードされている遺伝子であっても、 増殖を負に制御していたり、細胞死をレギュレートしたりする遺伝子(間接的、直接的 問わず)はタグをつけていても発現しにくかったりします。 発現に対して負の制御(プロテアーゼによる分解を含む)を受けているか、過剰な 発現に対して非生理的にでも除外するメカニズムが働いているかもしれません。 不思議なのは、発現がGFP単独に達しない場合で、プロテアーゼで分解されて GFPに近い大きさのプロダクトが見れる遺伝子もあるのですが、分解産物が 全く見られないけど、弱いと言うのもあります。分解のカスケードなどの 違いかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.2723-5 - 2009/01/25 (日) 06:37:17 - 酸性 GSTフュージョンでも起こりますが、C末からの長さの違ったデリーションのような感じの産物が得られることがあります。真核細胞では大腸菌細胞とはメカニズムは微妙に違うかも知れませんが、プロテアーゼによる分解がもっとも考えられると思います。 とくに融合部分に近い部分で分解が起こった場合は、質問のようなことがポストトランスレーショナルにおきるかと。 293Tでも経験があります。とくに発現が困難で、分解され安い蛋白に多いような気がします。

(無題) 削除/引用 No.2723-4 - 2009/01/25 (日) 02:21:00 - おお 書こうとして忘れていたのですが、コドンユーセージなどを介した翻訳 効率も挙げるべきかとおもってました。GFPに融合するわけですから、 GFPよりも翻訳に時間がかかることはお分かりいただけると思います。 その分効率が落ちる可能性はありますよね。

(無題) 削除/引用 No.2723-3 - 2009/01/25 (日) 02:10:02 - MK GFPに融合させているタンパク質の分子量が大きいと発現量や蛍光強度が弱くなる印象があります。 翻訳効率が落ちたり、融合蛋白質の半減期が短かったりしてGFPよりタンパク量が減少しているのかもしれません。 あとGFPタンパク質は四量体を形成して働くというのを聞いたことがありますので、融合蛋白質がその形成を阻害している可能性もあるかもしれません。そのような場合は単量体で機能するタイプのGFPを使えば改善されるかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.2723-2 - 2009/01/25 (日) 01:41:39 - おお GFPは従来マンマルなどにはないユニークなたんぱく質で、 さらに、細胞内で非常に安定で半減期がながい たんぱく質です。ですから、場合によっては過剰発現させた 細胞のライセートをSDSPAGEするとCBB染色でバンドを 確認できることがしばしあります。 そういうタンパクであっても、なにか細胞が持つ遺伝子 を融合すると、細胞内でのタンパクレベルの発現制御が かかることがたいていだと思います。 あとERということなので、サイトゾルに発現されたGFP より、存在できる空間が限られていることも影響している かもしれませんね。

GFP融合タンパクの発現が低すぎるのは。。。？ 削除/引用 No.2723-1 - 2009/01/25 (日) 01:14:42 - ボンド 教えてください。 現在、細胞にGFPをタグとして融合タンパクを細胞に発現させました。 この時発現checkにて、抗GFP抗体でIBするとGFPのbandはボコっとでますが、融合タンパクのバンドは非常に薄いです（ですが確かにsignificantに発現しています） 顕微鏡で観察すると確かにGFPの蛍光強度は比べにならないくらい低いです。ERに局在するタンパクでERに弱いながら蛍光が観察されます。 そのタンパクが元々発現させていない細胞に遺伝子導入しており、その融合タンパクを入れたときのみ、下流のシグナルがあらわれるので、その遺伝子はちゃんと発現しており、かつ活性を持っていると確信しています。 質問は なぜ融合タンパクにすると発現が低くなるのか。一般的によく見られる現象なのでしょうか？ （GFPにprimerを設計してq-RT-PCRやると、GFPとGFP融合タンパクとで差は認められませんでした。なので、遺伝子レベルでは同程度発現しています。） 教えてくださいませんか。

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