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(無題) 削除/引用 No.2726-13 - 2009/01/26 (月) 04:16:45 - おお DIGがついているから変なプロダクトができるというより、 修飾により最適な条件から離れてしまったという感じ なのではと思います。 じゃっかんPCRの条件を厳しくするかノンスペをおさえるため 添加物を加えるような作業がベターと、、、、 ねんのため、プライマーだけ流してみてください。もしかしたら なんか特殊なラベルのしかたをしてないかなって、その場合は プライマーのサイズが電気えいどうで見かけ上500bpくらいに きてもおかしくないですよね。

(無題) 削除/引用 No.2726-12 - 2009/01/26 (月) 02:10:33 - 大学院1年生 > AP　さん ありがとうございます。 伸長時間を短くして、再度試してみたいとおもいます。 ちなみに、DIGラベルのプライマー、しかも両方ともラベルしているから、このようなことが起こる可能性があるのでしょうか？ 別のラベル（例えばビオチン）にしたり、ラベルを片側にすると、 見かけ上の塩基数の違い（移動量の違い）や、ＰＣＲ産物の重合などが改善されるのでしょうか? ラベル無しのプライマーでは確認できていることから、ラベルの影響を色々と調べていますが、いまだ答えが見つかりません。 このような影響を調べるソフトやサイトはあるのでしょうか?

(無題) 削除/引用 No.2726-11 - 2009/01/25 (日) 17:46:47 - AP どのようなPCR条件なのかはわかりませんが、 サイクル過剰、鋳型過剰、伸長時間過剰などで、PCR産物の重合が起こることがあります。鋳型になるべき鎖の末端が、別の鋳型鎖の内部にミスアニールして伸長がおこったり、ひょっとすると3'末端がsnap-backしてヘアピン状の伸長がおこるためでしょう。その辺を考慮してやり直すのがいいのではないでしょうか（特に、今回は短いターゲットですから、伸長時間は取らなくていいくらいですね）。

(無題) 削除/引用 No.2726-10 - 2009/01/25 (日) 17:00:30 - 大学院1年生 ＞ＡＰ　さん 　本来のサイズは278bpです。 　ちなみに、末端をラベルしたプライマーを用いて30サイクルのPCRをしてから電気泳動しています。 　それでも、1.2kbpは増えすぎですよね？

(無題) 削除/引用 No.2726-9 - 2009/01/25 (日) 16:53:02 - AP >予想させるサイズに比べて1.2kbpぐらい増加しています。 それは、違いすぎではないでしょうか。 内部標識（合成の時にdUTPを4つ取り込むごとに1つにDIG標識がつく割合）ですら、非標識のDNAより、20〜30%くらい移動度が小さくなる位です。末端標識ならごくわずかしか変わらないはずです。 正当ではない産物が増幅されていそうです。ちなみに本来のサイズは？

(無題) 削除/引用 No.2726-8 - 2009/01/25 (日) 16:37:06 - 大学院1年生 ＞おお　さん 自分では分かってるつもりでしたが、読み返してみると変な文章ですね。 DNAが負電荷を持っていて、陽極側に引かれていく。 その移動量に関しては、アガロースの網目を短いＤＮＡの方が早くすり抜けるので、移動量が大きいと理解しています。

追加の情報です 削除/引用 No.2726-7 - 2009/01/25 (日) 16:29:50 - 大学院1年生 ＞おお　さん 情報不足ですいません。 予想させるサイズに比べて1.2kbpぐらい増加しています。 プライマーは両方ともDIGでラベルをしているとの情報は教えてもらっています。 ＞~　さん そういった確認方法があるんですね。 もちろん配列情報はあるので、切断部位をしらべてみて、確認してみようと思います。 それと、追加の質問なんですが、 分子量が影響するとのことですが、それはラベルしている分子量に比例するのでしょうか? 上にも書きましたが、上下の両方のプライマーをDIGラベルしているので、その分2倍の影響（移動度の減少）があるのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.2726-6 - 2009/01/25 (日) 16:22:37 - おお >[Re:1] 大学院1年生さんは書きました : > 今年度から大学院に入って、本格的に研究を始めた大学院生です。 > いつも参考にしています。 > > PCR後の電気泳動で、塩基の長さで移動量が違い、それが電荷の違いというのは分かるのですが、 これも勘違いしてますよね。 電荷の違いで移動度がきまるなら、マイナス電荷が多い長いDNA の方が早く移動するとも言えるのでは? 分かっているけど、表現が適切でないだけなのかなあ、、、 ある物体が電荷を持っていて、そこに電場がかかっている だけの話です。

(無題) 削除/引用 No.2726-5 - 2009/01/25 (日) 16:20:21 - ~ 目的の配列は分かっているのですよね。 その中央辺りに制限酵素サイトがあれば、切ってみてはいかがでしょうか。 シークエンシングの前に大体の確認ができます。

(無題) 削除/引用 No.2726-4 - 2009/01/25 (日) 16:13:03 - AP 線形の核酸の電気泳動では鎖長（分子量）の違いのみで移動度が変わります（環状など立体構造をとるものでは構造によっても移動度が変わる）。 一塩基に付き一個のリン酸基によってチャージが与えられるので、 常に総チャージ／総塩基数（移動を与える力／分子量）は一定で、もし、ゲルのような分子ふるいがない、水溶液中であれば、分子量に関係なく同じ移動度になるでしょう。 ところがゲルの分子ふるい（微少な網目）があると、短い物ほど通り抜けやすく、長い物ほど通り抜けにくいので、鎖長に応じて移動度の差異が現れます。 DIG標識はかなり大きな分子でヌクレオチドに修飾していますので、とうぜん取り込みによって分子量が大きくなるので、遅くなります。

(無題) 削除/引用 No.2726-3 - 2009/01/25 (日) 16:13:03 - おお >[Re:1] 大学院1年生さんは書きました : 。 > サイズとしては、予想されるものよりも大きくなっているので、ラベルしたことによる影響であれば、納得できますけど。 どれ位の長さで、電気えいどうじょうでどれくらいサイズが違うか 示してください。それでないといいかどうか答えられない とおもいます

(無題) 削除/引用 No.2726-2 - 2009/01/25 (日) 16:09:36 - おお >サイズ（分子量）は影響しないのでしょうか? 影響します。

PCR後の電気泳動での移動量について 削除/引用 No.2726-1 - 2009/01/25 (日) 15:55:44 - 大学院1年生 今年度から大学院に入って、本格的に研究を始めた大学院生です。 いつも参考にしています。 PCR後の電気泳動で、塩基の長さで移動量が違い、それが電荷の違いというのは分かるのですが、サイズ（分子量）は影響しないのでしょうか? 今、先輩の手伝いのために、DIGでラベルしたプライマーを用いてPCRをしていますが、目的のサイズが得られません。 ラベルしていないものでは確認しているので、理由が理解できません。 サイズとしては、予想されるものよりも大きくなっているので、ラベルしたことによる影響であれば、納得できますけど。 もう少し先輩と話して、条件検討をしてみて、どうしても改善されないのであれば、それをシークエンスしてみようと思いますが、 気になってしょうがないので、もしご存知の先生がおられるようであれば、ご意見をください。

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