全25件 ( 1 〜 20 )　 前 | 次 　1/ 1. 2. /2

(無題) 削除/引用 No.2738-25 - 2009/02/01 (日) 22:01:45 - genji ＞乳鉢の中に液体窒素をいれたらその組織に浸透してしまいますがそれは蛋白抽出目的なら問題ないのですか？教えてください． タンパク・核酸どちらも問題ないと思います。 私、muscleは基本的にポジトロンホモジナイザーでやってます。 あと、TENSU8 bufferというUreaを使った超強力な変性剤があります。 細胞ならあっという間に溶けますし、組織もすんなりです。 このbufferを浸して室温でタンパク・核酸をほっぽらかしに5年おいといても分解はありませんでした。 何かの参考になれば。。。（組成は文献を当たってみてください）

(無題) 削除/引用 No.2738-24 - 2009/02/01 (日) 18:39:44 - 名無し どうしても示したければ、抗体のエピトープ分かってるなら、その部分の十ないし十数残基ていどの合成ペプチド作ってもらって、競合させればどうでしょうか。（あるいは会社によっては抗体と別売りで抗原ペプチドを売ってるところもあるでしょう。）ポジコンのChAT横に流して染まったとしても、それは、使った抗体は、たしかにChATを認識できる抗体です、ということを示すのであって、1-D SDS-PAGEでライゼート流したレーンに見えているシグナルがChATですということの証明にはならないでしょう。（同じ分子量の別の蛋白質がたまたま染まったのではといううがった見方をされたときなどは反論できないし。）ただそこまできっちりヴァリデーションとる必要があるかどうかは、研究全体におけるこのデータのもつウェイトや、他のデータとの関係などで状況次第と思います。

成功しました． 削除/引用 No.2738-23 - 2009/02/01 (日) 06:05:17 - タンパック 皆様アドバイスありがとうございます． エレクトリックホモジナイザーを使う方法，また乳鉢を使うやり方の両方でやり何とかバンドが検出されました．ありがとうございました． いくつか質問があります． ・gengi様 乳鉢の中に液体窒素をいれたらその組織に浸透してしまいますがそれは蛋白抽出目的なら問題ないのですか？教えてください． ・その他の皆様 エレクトリックホモジナイザーを10秒5回（10秒間のインターバル）行いましたが，結局見た目上，筋肉が完全に壊れませんでした．最高回転でチューブ全体を氷で冷やしながら行いましたが，組織が粉々になって見えなくなるまで完全にやっても大丈夫でしょうか？ さらにその検出されたバンドが予想されるmolecular weightと一致はしていたのですが，それを証明するためにpositive controlを行いたいと思います．ただ，そのマウスの蛋白（ChAT）が手に入らない場合はどう証明すればよいのでしょうか？教えてください．ちなみにマウスではなくラットのは市販されていて，またマウスではペプチドだけが市販されていました．

(無題) 削除/引用 No.2738-22 - 2009/01/30 (金) 12:53:47 - genji やり方はいろいろあると思います。 乳鉢の中に液体窒素を入れてよく冷やし、液体窒素がなくならないように 注意しながら組織をすり潰せばよいと思います。 液体窒素がなくなりそうだったら乳鉢に追加するという感じで。 あとは名無しさまの方法でよいと思います。 温度が上がり、そのまま放置するとベタベタになるはずです。

(無題) 削除/引用 No.2738-21 - 2009/01/30 (金) 07:38:05 - 名無し ドライアイスを除いて、室温で少しおいて乳鉢がある程度まで冷たくなくなってきてから（冷たいと液が凍る）、乳鉢に（何回かに分けて少量ずつ）直接lysis buffer入れて洗い取る感じでホモジナイザーの方に回収すればどう。液量多すぎると薄まるからその辺は適当に加減して。

A様 削除/引用 No.2738-20 - 2009/01/30 (金) 03:25:27 - タンパック アドバイスありがとうございます。 EPtubeに組織（筋肉）を入れて、それを液体窒素で固めて、ドライアイス上にのせた乳鉢を使って破砕してみました。 すりつぶして粉々になった組織が乳鉢に張り付いて取りにくかったのですが、よい対策法などありますか？ ご教授ください。

(無題) 削除/引用 No.2738-19 - 2009/01/28 (水) 18:10:33 - A ホモジナイスに問題があると疑っているのであれば組織を 液体窒素とともに乳鉢を使って破砕するのはどうですか？ 何度か使ったことありますが液体窒素が存在している限り 凍結したままで目的のタンパク質が内在性プロテアーゼに よって分解されることはありませんから。破砕が甘いと 思うのであれば新たに液体窒素を加えて破砕を続ければ OKです。その後インヒビターカクテルを含む抽出溶液に 溶かして遠心すれば抽出できるはずです。目的タンパク質が プロテアーゼによって分解を受けやすい場合であっても 最短で抽出できるはずです。

(無題) 削除/引用 No.2738-18 - 2009/01/28 (水) 17:28:06 - けい >GLUT4様 ご返信ありがとうございました。 >私どもの研究室ではカクテルは使っておらず、leupeptinやDDT、そしてPMSFなど個別の阻害剤をいろいろ混ぜて使用しています。 PMSFが無いとカクテルだけでは阻害しきれないのか？と思ってあせりましたが、カクテルを使用していないとのことでしたので安心しました。私も阻害剤はおまじないのような物だと思って入れています。

(無題) 削除/引用 No.2738-17 - 2009/01/28 (水) 13:47:49 - タンパック GLUT様，うし様，名無し様などなど 貴重なご意見ありがとうございました． 今日一日中走り回ったらエレクトリックホモジナイザーを他のラボでみつけ借りれることになりました． とりあえず，やってみたいと思います． 知り合いに聞いてもエレクトリックホモジナイザーがないとできない，あるいはなくてもできるなど両方の意見があるようです． 万が一？またうまく蛋白検出できなかったらご相談させてください．3日後にはわかると思います，，，

(無題) 削除/引用 No.2738-16 - 2009/01/28 (水) 13:31:20 - うし 凍結組織をドライアイス上で冷却した乳鉢内ですりつぶし、粉末状になったらホモジナイザーに移し、ライシスバッファーを加えてホモジナイズすることで、ポリトロンがなくても効果的に溶解できるかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.2738-15 - 2009/01/28 (水) 13:30:48 - GLUT4 けい様 私どもの研究室ではカクテルは使っておらず、leupeptinやDDT、そしてPMSFなど個別の阻害剤をいろいろ混ぜて使用しています。 「>今まであまり気にしたことが無いのですが」ということですが、 私の師匠いわく「阻害剤はおまじないみたいなもんやからな〜（笑）」とよく言ってます。 実験がうまくいっているのであれば、あまり気にする必要はないと思いますよ。

(無題) 削除/引用 No.2738-14 - 2009/01/28 (水) 12:23:28 - けい > GLUT4様 横から申し訳ないのですが、 GLUT4様の研究室では、Protease inhibitor cocktailと同時にPMSFも加えて使用していらっしゃるのですか？　 今まであまり気にしたことが無いのですが、Protease inhibitor cocktailだけでなく、PMSFも加えた方がよいのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.2738-13 - 2009/01/28 (水) 07:23:57 - 名無し ビートビーダーというらしいです。ただいろいろな会社から似たようなのが出てるみたいで別の名前もあるみたいです。ガラスビーズやジルコニアビーズと混ぜて機械で激しく振るやつでその衝突の衝撃で細胞や組織が壊れるみたいです。もともと酵母や植物などホモジナイザーに適さない硬い材料の破砕によくもちいられてきたようですが、動物組織で使ってるひともいるという話を以前ききました。材料に応じてビーズの選択や最適な破砕条件があるらしいので、詳しくはメーカーによく聞いてください。

ありがとうございます。 削除/引用 No.2738-12 - 2009/01/27 (火) 23:31:02 - タンパック 名無し様 とてもためになるアドバイスありがとうございました。 問題はトリポロンタイプのホモジナイザーが近所のラボも含めてないことです。またご指摘のようにlysis bufferの量も増やしてみてもよいかと思いました。 ”ビーズで激しく攪拌する装置”は初めて知りました。探してみたのですがみつからず、もしHPなどわかりましたら教えてください。 どうするかはボスと話し合い次第ですが結果などでましたらまたご報告します。

(無題) 削除/引用 No.2738-11 - 2009/01/27 (火) 16:19:12 - 名無し 骨格筋や心筋はポリトロンタイプホモジナイザーでないとホモジナイズはかなり難しいと思います。使っていますでしょうか。やってみてわかると思いますが、もしポッタータイプだといつまでも塊が残っておそらくホモジネートにならないでしょう。あと名前は知りませんが最近よく使われている、ビーズで激しく攪拌する装置も筋組織の破砕には効果的ではないかとおもいます。 あと通常だと10%ホモジネート位でやると思いますが、壊れにくければ液量の割り合いを増やして5%ホモジネート位にしてみるのもいいかもしれません。 脊髄ではうまくいっているということなので、問題はホモジナイズが不十分で抽出ができていないか、存在量が少なくてトータルホモジネートでは検出しずらいか、ではないかと思います。後者なら、工夫して分画抽出してみるのも手です。たとえばまず界面活性剤なしbufferでホモジナイズして遠心して上清をとり（分画１）次に沈殿を界面活性剤ありのバッファーにけんだくして再度ホモジナイズして遠心し上清（分画２）をとり、最後に沈殿をSDSのような強力な界面活性剤入りbufferで溶かす（分画３）とか。 もしも使っているのが赤筋ならば赤い色はミオグロビンかもしれません。HbもMbも溶けてる蛋白質なので普通に遠心しても除けませんし、特にこれを除いても今の問題が解決するということではないように思います。すくなくとも骨格筋に関する限り（他組織でもおそらく）、血液由来の蛋白質が多いために量的な問題で組織蛋白質の検出が妨害されるということはないとおもいます。

(無題) 削除/引用 No.2738-10 - 2009/01/27 (火) 14:09:24 - おお >[Re:8] タンパックさんは書きました : > ”おお様” > 私も一つ気になっていることがありました．凍結切片（筋肉）をホモジナイズし，遠心分離後も上清のたんぱくの部分が血の影響で赤いんです．目的としているChAT蛋白は血液には含まれていないので取り除こうと20分ほどかけて遠心分離しましたが，結局はHb蛋白によると思われる赤いのが残ってしまいました． 凍結切片であればそのへんはもう分けようがないので、 可溶化されたものは全部使ってください。 なんとなく赤白いような、肌色っぽいライセートになることが あると思います。

(無題) 削除/引用 No.2738-9 - 2009/01/27 (火) 13:51:16 - タンパック ”EcoRI様” ありがとうございます． 目的とする蛋白は80kDa程で，ウエット式のブロッティングを行っています．

ありがとうございます． 削除/引用 No.2738-8 - 2009/01/27 (火) 13:48:09 - タンパック 皆様貴重なご意見ありがとうございます． ”名無し様” 今，とりあえず調べようとしていたのはChATです．ご存知かと思いますが，脊髄前角細胞で作られ，軸索を介してNMJにも分布します． b-actinに関しては再度私も調べなおします．いずれにせよ過去の文献では骨格筋のWBで検出されていました．ただあまりうまくいかないようなら他のGAPDHなどに変えるのも手かな？と思っていました． ”おお様” 私も一つ気になっていることがありました．凍結切片（筋肉）をホモジナイズし，遠心分離後も上清のたんぱくの部分が血の影響で赤いんです．目的としているChAT蛋白は血液には含まれていないので取り除こうと20分ほどかけて遠心分離しましたが，結局はHb蛋白によると思われる赤いのが残ってしまいました． 凍結切片の場合は還流固定されているわけでないので組織から血液成分を完全に除去できないわけでそこら辺をどうしたらいいか，アドバイスを頂けると助かります． ”GLUT4様” CCB染色したGELは転写後でした．ゲルドライしたのですが見えているのは50kDのIgGだと思われます． やはりご指摘の如くホモジナイズに原因があるのではと考えています． 基本的な質問で恐縮ですが，エレクトロニックホモジナイザーとはソニケイドするものとは別の器具なのですか？

(無題) 削除/引用 No.2738-7 - 2009/01/27 (火) 13:44:32 - EcoRI 大きいタンパク質はブロッティング装置を選ぶんじゃなかったでしょうか？ 確か、セミドライ式だと大きいタンパク質は移りにくいのでは？ あと、200 kDaだとばあいによっては濃縮ゲルに入っていかないかも？ そこらへんはクリアされてるんでしょうか？

確認ですが 削除/引用 No.2738-6 - 2009/01/27 (火) 13:18:55 - GLUT4 >gelのCCB染色はしたのですが，200kD付近には特に何もみえていません CBB染色したゲルは転写前・後のどちらですか？ 転写後であってもミオシンは見えていても良さそうですが。 20μgもアプライしていれば十分だと思いますので、 1度転写前のゲルか転写後のメンブレンをCBB染色してみることをお勧めします。200KDa付近にミオシン、40KDa付近にアクチンのバンドがはっきりと見えるはずです。 見えないもしくはぼんやりとしか見えないのであればホモジナイズが原因でしょう。 >エレクトロニックホモジナイザーを使っている人もいるようですがそこまでするべきでしょうか？ 私はいつもエレクトロニックで30000rpmで粉々にしています。 骨格筋は組織としては硬い部類に入るので、手動では難しい（手動を使ったことがないので推測ですが）ように思います。 これが一番の原因かもしれません。 >PMSFなどは含まれていなく加えた方がいいのかな〜と思っております 私共の研究室ではPMSFを入れています。 >b-MEをサンプルバッファーに入れて煮沸する際にいれているのですが 煮沸時でよいと思います。 まあ他の人の意見も待ってみましょう。

全25件 ( 1 〜 20 )　 前 | 次 　1/ 1. 2. /2

パスワードを入力してチェックした記事を

チェックした記事を

---