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(無題) 削除/引用 No.2742-13 - 2009/01/28 (水) 19:23:16 - AP 原理的に自発発光するluciferaseと励起が必要なGFPでは、GFPのほうが測定に干渉するファクターが多くて、直線性が低いでしょう。 たとえば、励起光が検体内のすべてのGFP分子に均等に当たらないでしょう。 光路に沿って近い方より遠い方が散乱、吸収によって励起光が減衰するでしょうし、GFP濃度が高いほど近位で吸収される励起光が多くなり、遠い方の減衰が大きくなるでしょう。 ルミノメータはフォトンカウントで発光強度を量子的にカウントするので、原理的にはゼロから天井なしで直線的に測定できます。 フロロメータはどうなんでしょう（使ったことがありません）？　フォトンカウント方式ならその点は同じかもしれませんが、CCDなどで蛍光強度を感光量として処理しているなら直線性は望めませんし、飽和も起こります。 ほかに、励起光と蛍光を分離するフィルターの干渉（散乱、反射、屈折など）が影響しそうです。

(無題) 削除/引用 No.2742-12 - 2009/01/28 (水) 17:59:45 - ＩＲＥＳ 以前、EGFPあるいはLuciferaseを同様の方法で多段階に発現量を振り、これらのレポーターの発現効率を追えないものかと試みたことがあります。細胞内に発現させたEGFPを検出するとなると、かなりの量を発現させ、細胞を溶解し、溶解液が均一な状態で測定しなければならないことが分りました。また、蛍光を測定する場合には溶液やディタージェントの自家蛍光(?このあたりは専門ではないのでこういっていいのか分りませんが...)の様なものを考慮しなければならず、とても多検体を解析するには不向きな印象でした。これに対して、Luciferaseでは少なくとも3桁まで直線性を維持しながらチェイスすることができました。GFPは日本分光のえらい高い機械を使わせていただきました。Lucは発光プレートリーダーを用いました。

(無題) 削除/引用 No.2742-11 - 2009/01/28 (水) 13:44:27 - おお >[Re:9] どっちもどっち？さんは書きました : > そもそもGFPは100％発現できるわけではないので、分析化学としての > 定量性は期待してません。 タンパクレベルではルシフェラーゼの発現とGFPの発現について区別できますか? GFPで100%期待できないコンディションならルシフェラーゼも発現にかんしては 100%を期待できないでしょう。ですからこの点については互角ではないでしょうか。 > > 酵素反応も必ずしも直線の相関にあるわけではないので、なんとも。 > どちらも、分析化学屋としての「定量」には当てはまらないので（スタンダードがあって、それに一致する、再現性、直線性）、定量に使おうとは思ってません。ただ相対的な比較に使ってます。 > ・・・きっと異論があるとは思いますが。 たしかに直線性を各実験で見るところまではしませんね。 ただ、ルシフェラーゼをつかったATPの定量では 非常に感度がいいですし、直線性もしっかりしています。 じっさいクルードな細胞での発現との直線性が不安であるというなら、 GFPの蛍光のほうが、感覚的には直線性を期待できそうな気がしてきます。 実際はどっちもどっちでしょうけど。

(無題) 削除/引用 No.2742-10 - 2009/01/28 (水) 13:23:26 - まりもに ああ、やはりおバカな考えでしたか。 培養細胞にプラスミドをトランスフェクトして、レポーター遺伝子の発現を指標としてプロモーター活性を評価する試験を考えていました。レポーターとしてLucかGFPかという選択で、GFPが使えればステップ数が少なくて楽そうです。ですが、細胞を顕微鏡で見ると、普通のGFPの場合、細胞核にGFPが入り込んでいるのが見えます。プロメガのリーフレットでLucの染色を見ると、ほとんど細胞質に見えます。GFPはLucより細胞溶解の条件をきつく設定する必要があるかと思っていました。ならば、NESを付加したGFPならば、蛍光分光光度計でいけそうですね？　そして、ダイナミックレンジを検討すると…、どうなるんでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.2742-9 - 2009/01/28 (水) 13:22:47 - どっちもどっち？ そもそもGFPは100％発現できるわけではないので、分析化学としての 定量性は期待してません。分子生物専門の方々は定量性あり、とおっしゃいますが。 酵素反応も必ずしも直線の相関にあるわけではないので、なんとも。 どちらも、分析化学屋としての「定量」には当てはまらないので（スタンダードがあって、それに一致する、再現性、直線性）、定量に使おうとは思ってません。ただ相対的な比較に使ってます。 ・・・きっと異論があるとは思いますが。

(無題) 削除/引用 No.2742-8 - 2009/01/28 (水) 12:54:31 - おお >[Re:7] まりもにさんは書きました : > GFPは核から取り出して均一な溶液に調製するのが大変なのではないかと思っていました。妥当な考えでしょうか。 え、なんで核、、、、

(無題) 削除/引用 No.2742-7 - 2009/01/28 (水) 12:47:45 - まりもに GFPは核から取り出して均一な溶液に調製するのが大変なのではないかと思っていました。妥当な考えでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.2742-6 - 2009/01/28 (水) 12:36:39 - おお >[Re:5] せぴーさんは書きました : > ルシフェラーゼよりもGFPの方が定量性はあると思います。 > なぜなら、ルシフェラーゼは酵素反応であり、GFPの蛍光量はタンパク分子数に比例した蛍光となるからです。 ん、だから両方定量性があると書いたんだけどなあ、、、、、 ダイナミックレンジは確かにルシフェラーゼのほうが優れてるかもしれません。 んでも両方とも光を検出するという意味では検出のダイナミックレンジに さが出るのはどういうことでしょうか、、、、、

(無題) 削除/引用 No.2742-5 - 2009/01/28 (水) 12:18:15 - せぴー ルシフェラーゼよりもGFPの方が定量性はあると思います。 なぜなら、ルシフェラーゼは酵素反応であり、GFPの蛍光量はタンパク分子数に比例した蛍光となるからです。 GFPがレポーター遺伝子としてあまり普及しないのは、検出の感度が低いからだと思います。 以前、PerkinElmerのARVOというプレートリーダーでGFPの定量化を行った経験があります。 定量性は濃度に依存して大変優れていましたが、感度が低く、ダイナミックレンジは2〜3桁が限界でした。 一方、ルシフェラーゼのダイナミックレンジはGFPと同等のサンプルを使用した場合6桁〜7桁であり、GFPと比べて高感度でした。 しかし、ルシフェラーゼにどの程度の定量性があるのかは、各々確認することが必要だと思います。 酵素反応は必ずしも直線の相関にはなりません。 最近の商品では定量性を謳ったものもありますが、実際に検討してみることをお勧めします。

(無題) 削除/引用 No.2742-4 - 2009/01/28 (水) 10:27:03 - おお >[Re:3] ともさんは書きました : > GFPは蛍光顕微鏡でみるときは定量性があまりない。 蛍光分光光度計があれば、定量性をクリアーできるのでは?

(無題) 削除/引用 No.2742-3 - 2009/01/27 (火) 19:19:31 - とも ルシフェラーゼがバックが低く感度高い。ルミノメーターさえあれば非常に簡単に定量可能。 GFPは蛍光顕微鏡でみるときは定量性があまりない。 FACSだと細胞のサンプルごとで細胞の大きさなど形が変化すると蛍光強度も変化するので、定量が多少難しくなるときがある。 しかし、どのくらいの割合でGFPが発現しているとか、GFPが発現している細胞だけ他のある遺伝子も発現しているとか、いろいろできる。 やる実験によって決めましょう

(無題) 削除/引用 No.2742-2 - 2009/01/27 (火) 19:09:30 - おお 定量性より感度の問題ではないだろうか とふと思った。

ルシフェラーゼとGFPの定量性の違い 削除/引用 No.2742-1 - 2009/01/27 (火) 18:39:11 - 健介 プロモーターアッセイなどには主にルシフェラーゼが使用され、定量的な解析がよく行われております。 ですがGFPでは蛍光強度の定量は一般的にされておりません。 短寿命のGFPであれば問題ないようにも思えます。 先輩から聞いた限りではルシフェラーゼは酵素だからとのことですが、イマイチよく分りません。 どなたか、なぜルシフェラーゼの方がGFPよりも定量性があるのか、教えていただけないでしょうか？ よろしくお願いします。

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