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(無題) 削除/引用 No.2746-11 - 2009/01/29 (木) 16:51:21 - A 以前ジンクフィンガータイプの転写因子を扱っていた知り合いは 培地にZnを入れておかないと発現タンパク質の殆どが沈殿に 行ってしまうと言っていたので必須かと思っていました。 >[Re:7] おおさんは書きました : > >[Re:6] たいあさんは書きました : > > 上手くいかなかった例ですが、 > > ジンクフィンガータイプの転写因子がどうしても > > 増えなかったので、培地に5mMくらい塩化亜鉛を > > 加えてみましたが、5ug転写因子/50ml培養液ぐらいで、 > > これ以上はもうむりかと思い、結晶化はやめました。 > > 結晶化メインでなかったので。 > > Znは加えたくなりますねたしかに、Znフィンガー具体的に > 見つかってなくても常に入れておいてやろうかとか思います。 > あとFeとか、、、TBではCaやMgをついかしますね。 > でも金属系は廃液で困りませんか? > > だれかほかに"え、"とか"なるほど"とかいうものを加えてないですかね > 、、、Coととか、、、 > > 5ugって生化学的には十分な場合がありますね。でも結晶か > では話になりませんね、無茶苦茶な両必要です。 > なんか改良して少ない量ですむようにならないのかな、、、

(無題) 削除/引用 No.2746-10 - 2009/01/29 (木) 07:37:34 - Homers 以前タンパク発現でトラブっている時に、結晶屋さんに伺ってこういう方法もあると教えてもらい実践してみたところ上手くいったものもありました。ただ、通常の方法では500ml LB cultureスケールでmg単位で取れるタンパクも、この方法では1/100もしくはもっと回収量は少ないので、何度かcultureしてpoolするか、大きなフラスコで振るかしないといけないのでちょっと労力は多くなります。

(無題) 削除/引用 No.2746-9 - 2009/01/29 (木) 05:33:13 - おお >[Re:8] Homersさんは書きました : > スタンダードなやり方では分解・inclusion bodyへ取り込まれてしまうというトラブルの時には、通常温度を下げて、IPTGの濃度を下げてゆっくりとタンパクを作らせるを試しますが、それでもダメな場合、IPTG 0.5~1mMの誘導後、37°Cで30min~1hという極めて短い時間に大腸菌を回収すると、少量ながらまだ分解やinclusion bodyに取り込まれていない、intactなタンパクを得る事が出来ました。条件を確認後にスケールを上げて目的量を回収した経験があります。 短時間の誘導は仰る通り、有効かもしれないと 常常思ってましたので、たまに自分で経験が ないにもかかわらず、偉そうにサジェスチョン したりしてます。30min-1hrは私も 考えていたレンジです。 でも試そうとしないので、説得力がないのか あまりうまく行かないという情報があるのかな とか、、、、思ったりもします。 一度試してみようと思っている方法です。 これってポピュラーですか?基本的に 時間の検討もすることがプロトコール集に 書かれて入ると思いますが。 ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.2746-8 - 2009/01/29 (木) 03:56:22 - Homers スタンダードなやり方では分解・inclusion bodyへ取り込まれてしまうというトラブルの時には、通常温度を下げて、IPTGの濃度を下げてゆっくりとタンパクを作らせるを試しますが、それでもダメな場合、IPTG 0.5~1mMの誘導後、37°Cで30min~1hという極めて短い時間に大腸菌を回収すると、少量ながらまだ分解やinclusion bodyに取り込まれていない、intactなタンパクを得る事が出来ました。条件を確認後にスケールを上げて目的量を回収した経験があります。

(無題) 削除/引用 No.2746-7 - 2009/01/29 (木) 02:42:50 - おお >[Re:6] たいあさんは書きました : > 上手くいかなかった例ですが、 > ジンクフィンガータイプの転写因子がどうしても > 増えなかったので、培地に5mMくらい塩化亜鉛を > 加えてみましたが、5ug転写因子/50ml培養液ぐらいで、 > これ以上はもうむりかと思い、結晶化はやめました。 > 結晶化メインでなかったので。 Znは加えたくなりますねたしかに、Znフィンガー具体的に 見つかってなくても常に入れておいてやろうかとか思います。 あとFeとか、、、TBではCaやMgをついかしますね。 でも金属系は廃液で困りませんか? だれかほかに"え、"とか"なるほど"とかいうものを加えてないですかね 、、、Coととか、、、 5ugって生化学的には十分な場合がありますね。でも結晶か では話になりませんね、無茶苦茶な両必要です。 なんか改良して少ない量ですむようにならないのかな、、、

(無題) 削除/引用 No.2746-6 - 2009/01/28 (水) 17:18:50 - たいあ 上手くいかなかった例ですが、 ジンクフィンガータイプの転写因子がどうしても 増えなかったので、培地に5mMくらい塩化亜鉛を 加えてみましたが、5ug転写因子/50ml培養液ぐらいで、 これ以上はもうむりかと思い、結晶化はやめました。 結晶化メインでなかったので。

(無題) 削除/引用 No.2746-5 - 2009/01/28 (水) 14:49:44 - おお >[Re:4] 淡白さんは書きました : > 挙げておられますが、高塩濃度やヒートショック。 > > http://www.pubmedcentral.nih.gov/articlerender.fcgi?artid=1865119 おーヒットショックってやってる人がいるんですね。 ヒートショックプロテイン(シャペロ二ン)をかんがえると 悪くない選択とおぼろげに思っていたのですが、、、、 ベタいんは知りませんでした。知識が広がりました。 大変感謝しています。

(無題) 削除/引用 No.2746-4 - 2009/01/28 (水) 14:40:57 - 淡白 挙げておられますが、高塩濃度やヒートショック。 http://www.pubmedcentral.nih.gov/articlerender.fcgi?artid=1865119

(無題) 削除/引用 No.2746-3 - 2009/01/28 (水) 14:33:21 - おお >[Re:2] ~さんは書きました : > 蛋白取りではなく、プラスミド取りの時の話ですが。 > 37度ではなく、39度の方が増殖が速いと言われて、 > 急ぎの実験の時には使っていました。 おーすげー、高温を実際使っている人がいる、、、、、 でもこうせい物質の安定せいとか気になるところですね。 カナマイシンは大丈夫かもしれませんね。 高温で増殖の早い変異株を作るともうかるかな。 たぶんむりだな、アイデアここに書いちゃったから、、、 パテント取りにくくなる。 >[Re:1] おおさんは書きました : > え、そんな事で発現が改善されたのという奇策があれば > 教えて頂けませんでしょうか。 ほかのとぴでも指摘がありましたが発現とかくと若干語弊が あるかもしれませんので、可溶画分の発現と訂正させて いただきます。

(無題) 削除/引用 No.2746-2 - 2009/01/28 (水) 13:17:26 - ~ 蛋白取りではなく、プラスミド取りの時の話ですが。 37度ではなく、39度の方が増殖が速いと言われて、 急ぎの実験の時には使っていました。 増殖が気持ち速くなり、見た目の大腸菌の濃さに見合ったプラスミドが取れていました。 タンパク質発現の場合にどうなるのかは知りません。

大腸菌での発現けいの工夫 削除/引用 No.2746-1 - 2009/01/28 (水) 12:13:52 - おお これに関する話題がチラホラと最近あがってますが、便乗して ちょっと興味本位的なところもあるのですが、お伺いしたいと思います。 大腸菌でリコンビナントたんぱく質を発現させる系で、プロトコール 的には温度を下げるとか、IPTGの濃度をかえるとか、 バイチをリッチにするとか、プあーにしてみるとか、 高塩濃度にしてみるとか、シュークロースをいれるとか、 まいろいろなサジェスチョンが見られるのですが、 え、そんな事で発現が改善されたのという奇策があれば 教えて頂けませんでしょうか。実際にやったとか、 文献で見たとか、、、、、 たとえば温度を実際に37度から下げるということは 幅広く応用されていると思いますが、42度で培養したら 改善されたとかみたいな。 現在具体的にそういう実験で困っているわけでは ありませんので、実験けいを突っ込まれてもお答えできません のであしからず。

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