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(無題) 削除/引用 No.2760-13 - 2009/01/31 (土) 17:59:15 - おお >[Re:12] 名無しさんは書きました : > 今思ったのは、せっかく硫安分画やったのなら、それをそのままオープンカラムの疎水（的相互作用）クロマトグラフィーにもって行くという方法もあるとおもう。そしたら濃縮と精製ができるなと。 そうですよね。私もそう考えます。といいますか昔の師匠がそういう考えでした、 硫安画分を高い塩濃度を維持したままかけた時に、くっついてしまったので、 それじゃあということでそのゲルで疎水クロマトをしてと方針をかえたと いってました。ついでに疎水クロマト用に、その支持体にハイドロ ホーピックなものをつけて売れば良いとメーカーにいって作らせてたそうです。 そのご、殆どそういうゲルにつかないタンパクや、くっつくとあグッてしまって 落ちてこないタンパクも経験し、難しいもんだなあとおもうようになりました、

(無題) 削除/引用 No.2760-12 - 2009/01/30 (金) 15:12:17 - 名無し 今思ったのは、せっかく硫安分画やったのなら、それをそのままオープンカラムの疎水（的相互作用）クロマトグラフィーにもって行くという方法もあるとおもう。そしたら濃縮と精製ができるなと。精製したい蛋白質が沈殿する硫安濃度よりも少し低いくらいの硫安濃度にあわせてアプライし、ステップワイズ　or 高から低への硫安の下降濃度勾配で溶出。濃度勾配だとけっこうブロードに出てくることがおおいけどまあいい。酵素とかよく硫安けん濁液で売っているように、硫安は蛋白質の安定化にはむしろよい効果があると思うし、ここで精製度をupさせるのもいいと思う。疎水クロマトの担体とか硫安の疎水クロマトのやり方は、蛋白質酵素の基礎実験法（南江堂）に出てる。やり方だけでなくて実際の実験の例とか難しい原理とかも出ててかなり詳しい。学生さんとかよく使う本だから学校の図書館にたぶんある。

(無題) 削除/引用 No.2760-11 - 2009/01/29 (木) 23:04:02 - おお あ、硫安画分をゲル濾過に乗っけた時に高濃度硫安が含まれてたために、 カラムの支持体と疎水相互作用をして、くっついてしまったという話 を聞いたことがあります。

(無題) 削除/引用 No.2760-10 - 2009/01/29 (木) 22:45:32 - おお コファクターやコンプレックスの分離により活性が落ちたりする場合 もあるので、その変の考察もしておくべきでしょう。

(無題) 削除/引用 No.2760-9 - 2009/01/29 (木) 22:43:05 - おお あ、PEGはたまに微量の小さい分子量のフラグメントが 膜内部に入って悪さすることはあります。 溶液を作ってPEG自体透析したあと、それを 外液にしてサンプルを濃縮というのもてかもしれません 、、、手間かかりますね、、、 って自分でいっといて

(無題) 削除/引用 No.2760-8 - 2009/01/29 (木) 22:41:06 - genji 私もどんなカラムを使っているのか気になります。 カラムに吸着されたままで溶出してこないという可能性はありますか？ タンパク質濃度が極端に低いということですので。。。

(無題) 削除/引用 No.2760-7 - 2009/01/29 (木) 22:38:29 - おお カラムで2800倍に希釈されるのは、異常です。または特殊なケース かもしれません。あと、その活性は単一のたんぱく質由来でしょうか? いろんなたんぱく質が活性をもっていて、カラムのいろんなフラクション に活性が出ているとか、、、あと活性を測る方法論的に なにか難があるとか、、、、 吸着できるカラム(イオン交換、疎水クロマトなど)であれば、濃縮は 可能です。 アセトンは有機溶媒のなかでは比較的マイルドで活性を維持するタンパクも ありますが、失活するものも多いかもしれませんね。 ちょっと変わった濃縮法として、透析バックにサンプルをいれて、 外からPEG粉末をかけるとか、非常につよい透析膜を使い、 サンプルをいれて、外圧をさげて、水をしみ出させるとか いうのもあります。 あとプレパレーションスケールの等電点電気えいどう でしょうかね。等電点電気えいどうようキャリアーを サンプルにまぜて、通電させるだけです。

(無題) 削除/引用 No.2760-6 - 2009/01/29 (木) 22:14:12 - A 凍結乾燥で濃縮する場合、バッファーも濃縮されますがその辺りは 大丈夫ですか？もし界面活性剤などが入っていると凍結乾燥後 ゲル上の物質が析出したりします。 > 限外ろ過なのですが、目的のタンパク質の分子量もわかっていません、 >また、希釈されているため、どのフラクションに活性があるのかも定かでは>ありません。 サンプルの量がどれほどあるのかわかりませんがもし十分にあるのなら 同じサンプルをMWCOの異なる複数のAmiconを使って濃縮するのはどう ですか？もしMWCOの大きいものの抜けからだけ活性が見られれば目的 タンパク質の分子量をある程度推定できるかも知れません。

訂正 削除/引用 No.2760-5 - 2009/01/29 (木) 21:25:16 - 名無し すいません。さきの文章の第２段落が変でした。下記のように訂正します。 カラムに通して希釈されてしまったということですが、どのようなカラムでしょうか。もしかするとカラムサイズが大きすぎて溶出液の液量が多くなってしまったのかもしれないですが、その辺はどうでしょう。もしステップワイズで溶出するならば、すくなくともアプライするサンプル液量よりカラムボリュームが同じか小さければ希釈し過ぎることはないと思います。蛋白質を含んでいる液だけを回収できるようにステップワイズ溶出でもフラクショネーションして下さい。まとめて溶出液をプールすると蛋白質が溶出したあとの溶出液まで混ぜてしまい希釈させてしまいます。 濃度勾配による溶出では勾配が緩いとブロードにだらだら溶出されてきて希釈されてしまうので、もしそういう感じなら、精製度はあまり上がらないかも知れないですが、勾配をきつくして少ない数のフラクションに集められるようにするのも手です。

(無題) 削除/引用 No.2760-4 - 2009/01/29 (木) 21:18:26 - 名無し 蛋白質の活性を保持する必要がある場合は、メタノールやアセトンなどの有機溶媒は適切でないと思います。多くの場合失活します。 カラムに通して希釈されてしまったということですが、どのようなカラムでしょうか。もしかするとカラムサイズが大きすぎて溶出液の液量が多くなってしまったのかもしれないですが、その辺はどうでしょう。小さなサイズ（もし濃度勾配でなくステップワイズで溶出するならば、すくなくともアプライするサンプル液量よりカラムボリュームが同じか小さければ希釈し過ぎることはないと思います。）濃度勾配では勾配が緩いとブロードにだらだら溶出されてきて希釈されてしまうので、もしそういう感じなら勾配をきつくして少ない数のフラクションに集められるようにするのも手です。この場合、蛋白質を含んでいる液だけを回収できるようにステップワイズ溶出でもフラクショネーションして下さい。まとめて溶出液をプールすると蛋白質が溶出したあとの溶出液まで混ぜてしまい希釈させてしまいます。 あと蛋白質濃度が薄い状態で置いておくことは失活や吸着ロスなどの原因になるので、精製過程ではできるだけさけた方がいいです。限外濾過濃縮は膜への吸着で活性をロスする場合があり、とくに、きょう雑蛋白質が少なくなっている精製後期では避けた方がいいように思います。透析でも似たようなトラブルが起こることがあります。 私も今回のような場合は凍結乾燥かあるいは小さいサイズのカラムでクロマト（イオン交換とかアフィニティークロマトなど）して、ステップワイズで溶出するのかがいいかなあとおもいます。精製はステップごとに回収率は低下していきます。不安定だったり吸着しやすかったりする蛋白質だと、最終的な回収率わずか数％程度ということもあります。ですから（これは精製度との兼ね合いでもありますが）きるだけ少ないステップで精製が完了することが活性の収量を確保する上でとても重要なので、避けられるものはできるだけしないですむような周到な精製計画を、あるていど精製の経験のある人と相談して組み立てるのが良いと思います。

(無題) 削除/引用 No.2760-3 - 2009/01/29 (木) 19:56:26 - aska 回答ありがとうございました＾０＾ 濃縮させたタンパク質は、硫安分画で得られたサンプルです。 それをカラムに通したところ、得られたタンパク質濃度が2800倍希釈されてしまい、活性が見られなくなってしまったことから、タンパク質濃縮を考えました。 限外ろ過なのですが、目的のタンパク質の分子量もわかっていません、また、希釈されているため、どのフラクションに活性があるのかも定かではありません。 明日、凍結乾燥を用いたタンパク質濃縮を行おうとしています。 他に上記以外で何かありましたら、教えてください＾０＾

(無題) 削除/引用 No.2760-2 - 2009/01/29 (木) 19:37:39 - genji 私の経験上アセトンやメタノールだと変性する場合が多いです。 （酵素によりますが） 硫安で沈殿させたり、限外ろ過、凍結乾燥、液クロ等で濃縮できませんか？

タンパク質の濃縮と精製 削除/引用 No.2760-1 - 2009/01/29 (木) 19:22:02 - aska 困っているので教えてください。 肝臓中の酵素を精製するために、カラムを使って溶出した目的の酵素を含む溶液をアセトンで濃縮していますが、取れてきたタンパク質の活性が見ることが出来ません。 ポジコンとして、活性のある市販のタンパク質を同じようにアセトン濃縮しても、それとメタノール濃縮しても活性がなくなってしまいます。 他にどのような濃縮方法がありますか？教えてください＾０＾

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