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(無題) 削除/引用 No.2803-3 - 2009/02/05 (木) 21:08:23 - TWO　DOGS 免疫屋さん アドバイスありがとうございます。頂いたご質問に対し、以下に回答しました。 「1.付着しているのは本当にリンパ球でしょうか（マクロファージやファイブロなど）」 2日経っても細胞は球状で、Mφやfibroのような形はしていませんし、抗CD3抗体やPHA-Mに反応して幼若化・増殖していますので、リンパ球ではあると思います。もちろん一部混じってはいると思いますが、ごく一部かと思います。 2.遠心操作にて落ちなかった無刺激細胞は，ちゃんと生きていますか？ トリパンブルーで測定したところ、86-91%は正細胞でした。 本日、播種2日目ですが、Con A刺激のみ幼若化は見られませんでした。当たり実験なので、適当な論文を参考した濃度なので、今後濃度検討が必要ですが、不思議なのはCon A刺激の細胞はほぼ100%底面に強力に接着し、全くはがれないことです。細胞は球形ですが、採取時とほぼ同じ大きさでした。他の刺激を加えた細胞は半分以上は浮遊です。 プレートはBD Falconのマルチウェル™セルカルチャープレート（カタログ#：353047）を使用していますが、細胞の接着を強くする表面処理をしているとあったので、メーカーに問い合わせたところ、リンパ球が強くくっ付いたのは、表面処理の可能性があるとのことでした。 すみません、まとまりのない回答になってしまいました。

(無題) 削除/引用 No.2803-2 - 2009/02/05 (木) 03:25:07 - 免疫屋 通常リンパ球はプレート（通常のtissue culture coatedですよね？）には強固に接着しません． 300Gの遠心で落ちます． 以上から考えて逆にお伺いですが， 1.付着しているのは本当にリンパ球でしょうか（マクロファージやファイブロなど） 2.遠心操作にて落ちなかった無刺激細胞は，ちゃんと生きていますか？ 通常の培養用プレートにリンパ球が強固に付着するというのは非常に不自然ですので，浮遊培養プレート（non-coating plate？）などを考える前に改善しなければいけない問題だと思います． ごくごく一般的な解析手法なのですから，変な細胞や変な培養方法で無理矢理結果を得るより，常法に従って結果を得るほうが理解も納得もされやすいと思いますけれども．

リンパ球のプレート接着の強さについて 削除/引用 No.2803-1 - 2009/02/04 (水) 23:19:09 - TWO　DOGS ラットの腸間膜リンパ節細胞を用いて、マイトジェン刺激後の増殖アッセイを行っています。困っているのは、1日以上培養すると、リンパ球が24穴プレートからほとんど離れないことです(24穴を使っているのは、今後行う実験条件によるものです)。意味が分からないと思いますので、まず実験法を簡単に説明しますと、 �@ラット腸間膜リンパ節摘出後、PBS(-)内でピンセット、鋏でほごす �Aナイロンメッシュを通す �B遠心、上清除去 �CPBS(-)に浮遊して、比重遠心分離法で、リンパ球層採取 �D数回洗浄後、無血清培地（AIM-V＋50μM 2ME）に浮遊し、培養ディッシュに播種 �E5%CO2インキュベーター、37℃、1時間培養後、浮遊細胞を採取し、細胞生存率、細胞数測定。（生存率99%） �F7×10^5個／0.25mL／well（24穴）で播種（プレートは浮遊細胞用ではなく、一般の接着性細胞に用いるものです） �G1)無刺激、2)ConA、50μg/mL、3)PHA-M、20μg/mL、4)抗CD3抗体、1μg/mL coating、で1〜3日培養（5%CO2インキュベーター、37℃） �H培養終了8時間前に3H-Thymidine、1μCi/well添加 この後がお聞きしたい部分です。Thymidineの取り込み終了後に、細胞を洗浄するのですが、300×G（あるキットの説明書に、96穴を用いた浮遊細胞の洗浄方法に倣った）でプレートを遠心しても、無刺激の細胞の多くは浮遊状態で、洗浄作業を行えません。細胞を採取して、チューブに移して洗浄しようとしても、特にCon A刺激では、強くシェイクしても、強くピペッティングしても、9割以上の細胞は強固に底面から離れません。結局、シェイク、ピペッティングを繰り返し、細胞を可能な限り浮遊させてから、Trypsine-EDTA処理（0.2mL）して細胞を剥がし（これでもConA刺激の細胞は5割程度は剥がれませんでした）、更に1mLのPBSで強くピペッティングして、これらをプールして、洗浄作業を行いました。Thymidineの取り込み量は、ConA以外は予想通りでした（ConA刺激の細胞は、半分近くの細胞が採取できなかったので、あまり前ですが。）。 長くなりましたが、リンパ球って、こんなに強くプレートにくっつくものでしょうか？お聞きしたいのは（ご経験があれば助かります）、 �@リンパ球を簡単にプレートから剥がすには？ �A浮遊細胞用のプレートは、簡単に細胞採取可能か？ �B浮遊細胞用のプレートでも、抗CD3抗体のコーティングは可能か？ �C逆に、リンパ球を強固にプレートに接着させる方法は？ �D24穴でなく、96穴プレートなら、遠心で底面に完全に落として、洗浄可能か？ �Eflat bottomでもround bottomでも効率的に遠心で細胞は沈められるのか？（上記のキットはFlat bottomでした） �F�Eでflat bottomがOKなら、24穴でも問題ないのではないだろうか？なぜ、24穴の無刺激リンパ球は遠心後浮遊していたのか？ �Gpoly-L-lysine coatingプレートは有効か？ 当所には、セルハーベスターなるものが無くて（論文、成書を読むと、これを使っているのがほとんど）、細胞をプレートに接着させたままか、剥がしてチューブに移すかなどして、細胞を洗浄する必要があります。何かアドバイスを頂ければ、あるいは全く別法でも結構ですので、よろしくお願いします。

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