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(無題) 削除/引用 No.2806-8 - 2009/02/07 (土) 14:32:50 - おお >[Re:4] TKさんは書きました : はっきり言って何が起こっているか分かりません。 こういう時にわたしがやる一つのては、そのシステムは その実験に合っていないので、違うシステムを導入する です。 血清はたんぱく質も豊富でそれだけでもなにか違うことが 起こりそうな気がしますが、そういう観点でなにか できるかもしれないと思うことは、洗じょうの回数を 増やす。デタージェントの量をふやすとか変える( そのシステムで使用かのうなはいんで)。 塩濃度を上げるとかでしょうか、、、、 > サンプルの希釈試験は、80・60・40・10%で行っていますが、なかなかきれいな直線は得られていません。 何か傾向はありませんか? 低い濃度のほうが多いエスティメーションになるとか、、、、

(無題) 削除/引用 No.2806-7 - 2009/02/07 (土) 05:29:01 - ？ >サンプルは同一プレート内で5回測定しましたが、値は安定（CV値5%以内） ↓

(無題) 削除/引用 No.2806-6 - 2009/02/07 (土) 03:33:23 - A TKさん サンドイッチタイプで競合的ELISA法ではありませんが何年かELISAの 経験があります。TKさんは現在実験系を立ち上げているとのことですが ELISAの経験はどれぐらいありますか？もし最近初めて経験したので あればピペッティングをよくよく確認してください。私も初めてELISA を使った時には同じサンプルを使っているのに同じ結果が出なくて 困ったことがありました。最終的にわかったのはそのばらつきの原因は ピペッティングにあったということです。どの様に行なわれているのか わかりませんがもし行なっていないのであれば同じプレート上でひとつ のサンプルに3-well使ってデータの分散を調べてみればわかります。 検量線の分散も確認されるといいかもしれません。もしサンプルを 測定範囲に持ってくるために大きなdilution factorを使っているので あれば感度の高いELIZAは簡単にピペッティングでの違いを示します。

(無題) 削除/引用 No.2806-5 - 2009/02/05 (木) 14:25:47 - 免疫屋 TKさん 回答ありがとうございます． おおさんと同じくスタンダードが同じ点からlot差ではない可能性を疑っていたのですが，いろんな状況を勘案してlot差を疑う形に落ち着いたわけですね． でもなぜスタンダードは同じなんでしょうかね？ スタンダードが同じなので必ずしもlot差と断言できる状況ではないかもしれませんが，それを疑う状況でもありますので，そのようなlot差が出るような粗悪（と言っちゃいますが）なプレート自体を変えてみてもとも思います． あまり解決になっていませんが…

(無題) 削除/引用 No.2806-4 - 2009/02/05 (木) 14:05:25 - TK 早速のご意見ありがとうございます。 ご指摘のことを検討してみました。 測定間変動-別の日に行っています。 サンプルの凍結融解‐すべて小分けにしているので、融解後に凍結をすることはありません。分ける前の攪拌には問題がないと思います。 測定値-サンプル5検体を測定しましたが、測定値が2倍異なるものもあれば3-4倍異なるものもありました。 また、サンプルは同一プレート内で5回測定しましたが、値は安定（CV値5%以内）しているので測定内変動に関しては問題ないと思われます。 同じlotのプレートで同様の実験を2回行いましたが、同じような結果が出ています。 サンプルの希釈試験は、80・60・40・10%で行っていますが、なかなかきれいな直線は得られていません。 血清にスタンダードを加える方法は行っていませんが、添加回収試験では、100%前後の回収率が得られています。

(無題) 削除/引用 No.2806-3 - 2009/02/05 (木) 13:09:02 - おお スタンダードに変動がなければ、ロットの違いと言いがたいのでは ないでしょうか、、、、、 サンプルで希釈系列を作ると直線性がありますか? 同一プレートでnはいくらですか? nが複数の時どの程度バラついてますか? 血清の妨害なら、血清にスタンダードを加えても 低く見積もられるかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.2806-2 - 2009/02/05 (木) 12:53:14 - 免疫屋 まずご提案ですが，この測定値差がlot差に依存すると判断された根拠を明確にされてはと思います． 以下思いつきですが， -測定間変動とありますが，同じ日に実施したのか別の日なのか -サンプルは凍結融解を繰り返したのか否か -サンプルを小分けして保存していた場合，小分け前の撹拌は充分であったか -すべてのサンプルが2倍以上違ったのか（特定のサンプルのみか） -同じプレートで同じサンプルの場合，値は安定していたのか（トリプリ等） -同じlotの別プレートでは同じ結果が得られたのか などが判断材料になると思いますので記されてはと思います．

ELISA法プレート製造lot番号による測定値の違い 削除/引用 No.2806-1 - 2009/02/05 (木) 11:41:41 - TK 大学院修士１年の者です。 競合的ELISA法によるタンパク質測定法の確立を行っています。 現在、測定値の測定間変動を検討している所ですが、異なる製造lot番号のプレートを使用すると、血清試料の測定値が2倍以上異なる結果となりました。また、異なるlot間での血清試料間の測定値の比は異なるものでした。 実験方法は、�@−�Dの通りです。 �@IgGコーティングプレートに目的タンパク質のモノクローナル抗体を結合させる（1日インキュベート） �A血清試料とビオチン化トレーサーを添加し、競合させる（1日インキュベート） �BアビジンHRPを添加する（1時間インキュベート） �C基質を加え、発色させる（30分反応） �D酸で反応を停止し、吸光度を測定する ちなみに検量線はlot番号によらず同じ結果で、血清試料の吸光度のみ異なる結果となりました。 異なるlot間での測定値補正や、血清試料中の妨害物質の影響など、皆様の経験から情報がありましたら、解決法・アドバイスをお願いします。

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