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(無題) 削除/引用 No.2819-9 - 2009/02/09 (月) 08:59:56 - DNAI 以前ここで教えて頂いた検出用二次抗体のTrueBlotはかなりいいですよ。 マウスとラビット用があります。 ＷＢの露光を伸ばすと少しずつＨ鎖のバンドは見えてきてしまいますが。

(無題) 削除/引用 No.2819-8 - 2009/02/09 (月) 03:09:59 - 似た者 同じ様な問題に直面して、最近これを購入してみた。まだ届いていないので使えるかは不明。 http://www.technochemical.com/pierce/protein/detection/clnblt/clnblt.htm

(無題) 削除/引用 No.2819-7 - 2009/02/09 (月) 02:46:59 - ポム 二次抗体ではないのですが、直接一時抗体をHRP標識するキッットがGenScriptから出ています。これのおかげで、H鎖近くの50 kDa付近のタンパク質でさえCo-IPのデーターがきれいに取れるようになりました。 ウサギ抗体ですとOne Stetp Western Basic Kit (Rabbit), L00204, 195$です。 ご検討ください。

(無題) 削除/引用 No.2819-6 - 2009/02/09 (月) 00:25:35 - じじ ウエスタンで変性したH鎖とL鎖を認識しない2次抗体 ずばり、メーカーか型番を教えて頂けると助かります！！ 横着で申し訳有りません。。

(無題) 削除/引用 No.2819-5 - 2009/02/08 (日) 16:32:53 - C ライゼートを遠心した沈殿にはよくわからないゴミとか細胞の残査などが含まれていますね。混入したものが肉眼ではほんの僅かでも蛋白質として考えたらとても多いですね。混入した不溶物はこのbufferには溶けなかったものですから、その後の洗浄などでも遠心すればIP物と挙動をともにして、結局、精製品のバックグラウンドになってしまいます。はじめの遠心で上清をとるときは、あまりギリギリまでとらずに、数十μlくらい残すように、余裕をもって取った方が安全と思います。まあ、失敗したらもう一度遠心すればいいだけですが。

(無題) 削除/引用 No.2819-4 - 2009/02/08 (日) 10:09:05 - とも ウエスタンで変性したH鎖とL鎖を認識しない2次抗体があります。それを使えばH鎖とL鎖検出されませんのでそれを使ってみては？？

(無題) 削除/引用 No.2819-3 - 2009/02/08 (日) 04:24:07 - じじ C様、早速のコメントありがとうございます。 "あとIPの前のライゼートの遠心はしっかりやって沈殿吸い込まないように慎重に上清をとるのも大事です。" 初歩的ですいませんが、沈殿を吸い込んだ場合、どんなリスクがあるのでしょうか。。？

(無題) 削除/引用 No.2819-2 - 2009/02/08 (日) 04:09:07 - C ２次抗体の代わりにHRP標識protein A はどう。感度は少し下がるけど変性したIgGとはほとんど反応しないから、igGのバックグラウンドの問題に関しては改善されると思うけど。あとマウスモノクロやヤギや羊ならHRP-protein Gでやる。それがいやなら、抗体／IgGをproteinAまたはGビーズに架橋剤使って共有結合させてしまうといい。 バックが高いのが非特異的な吸着によるならプレクリーニングすることである程度よくなるでしょう。あとIPの前のライゼートの遠心はしっかりやって沈殿吸い込まないように慎重に上清をとるのも大事です。

免疫沈降のバックグラウンド 削除/引用 No.2819-1 - 2009/02/08 (日) 03:48:27 - じじ いつも勉強させて頂いております。現在免沈で困っていることがあります。 ネガコンとしてIgG（市販されているもの）を用いているのですが、困ったことにネガコンでもポジ並みにバンドが出現してしまっています。輪をかけてややこしいのが、目的とする蛋白がIgG（H鎖）と極めて近いサイズにあるため、ポジかネガかの判断が非常に難しくなっております。 例えば、蛋白の特性によって、本当にIgGに（非特異的？）にひっつくやすくてこのような結果を生んでいるとも考えられるのでしょうか？それとも単純に、洗浄プロセスや、免沈の条件設定（バッファー濃度や抗体濃度）の問題なのでしょうか？ ご意見を頂けると助かります！

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