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(無題) 削除/引用 No.1020-5 - 2011/10/07 (金) 07:45:51 - 浮遊細胞 皆様、 アドバイスをいただき誠に有り難うございます。 うん様 実験の詳細を省いて申し訳ありません。 現在の実験ではソート後に刺激する必要があるため、 RNA抽出試薬に直接ソートするという方法は取れないでおります。 - ~様 確かにIsogenLSならギリギリまで吸わなくてよくなりますね。 RNeasy kitに付属のRLT lysis bufferだとどのくらい許容するものか、メーカーに問い合わせてみようかと思っています。 １２３様 ２０００個でも大丈夫というのは心強いです。 伺いたいのですが、そのときはisogenで溶解、RNA抽出をしてから、 RNeasyで精製したということでしょうか。 もしくは最初からRNeasyキットを使われたのでしょうか。 後者でしたら、もう少し詳細を教えていただけないでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.1020-4 - 2011/10/06 (木) 22:28:48 - 123 10000cellsはそう少ないとは思いませんけど。sortingの後、遠心してcountすると回収率50％程度になります。多くても60％ぐらいです。FACSの調子次第では20-30%になっていることもあります。PC表示で10000個ではなく、遠心後110μLに溶媒を減らして10uLでカウントした方がいいのではないでしょうか。 Isogen なら100uLぐらい液体が残っていてもRNAはとれます。 QIAGEN RNeasy microでcarrier RNA を使えばqPCRは2000個でもいけました。500個でも回収できるとマニュアルには書いてあります。

(無題) 削除/引用 No.1020-3 - 2011/10/06 (木) 10:18:57 - うん sortingした細胞がダイレクトにRNA抽出試薬に入るようにしておけばいいのでは？ 私はそれでしています。

(無題) 削除/引用 No.1020-2 - 2011/10/06 (木) 09:17:38 - ~ >PBSを最後まで吸わずに、細胞溶解に進んでよい 抽出試薬をISOGEN-LSのような血液サンプル用の試薬にすれば、 少なくとも細胞ペレットから上清を完全に除かないといけないという心配からは開放されるでしょう。

少数の細胞からのRNA抽出のコツ 削除/引用 No.1020-1 - 2011/10/06 (木) 06:33:08 - 浮遊細胞 いつも勉強させていただいています。 ソーティングで得られた10ｋ個程度の浮遊細胞を対象に遺伝子発現解析を行おうとしています。 この作業における懸念として、細胞数が少ないため遠心による細胞洗浄、回収の際に ペレットが殆ど見えず、作業中にロスをしているのでは、ということがあります。 DNAやRNAのエタ沈などでは共沈剤などを利用できますが、 細胞ではそうもいかず、なかなか安心できません。 少数の細胞を扱ったご経験のある方でなにかよいコツをご存知でしたらアドバイスいただけないでしょうか。 例えば、PBSでの洗浄時にPBSを最後まで吸わずに、細胞溶解に進んでよいということはあるでしょうか。 よろしくお願いします

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