全7件 ( 1 〜 7 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

(無題) 削除/引用 No.1084-7 - 2011/10/19 (水) 16:17:33 - う 失礼しました。 total lysateでの活性評価ですね。 私が知る限りでは http://www.sciencemag.org/content/316/5829/1349.full この論文では細胞をfractionationして、proteasomeが含まれる画分をproteasome源としてますね。 それで、指キチンさんがお示しになられたペプチドの分解で評価されてますね。 momさんのご指摘通り、SDSは0.025 %加えるとのことです。

(無題) 削除/引用 No.1084-6 - 2011/10/19 (水) 09:30:22 - mon うさんの指摘にありますように、３つの酵素活性を測る蛍光基質が販売されています。 また、特異性に関しては、阻害剤の効果も見ておいた方がよいと思います。 もっとも100%阻害にはならなかったような。 ＞ダイレクトに20S内に送り込まれ... 能動的というより受動的拡散だと思いますが、自信はないです。 なお、20S精製品を購入すると、低濃度SDSで活性化する必要があります。

(無題) 削除/引用 No.1084-5 - 2011/10/19 (水) 09:29:25 - 指チキン う様 コメントありがとうございます。 現在使用している酵素源サンプルは血球のトータルライセートで，他の蛋白分解酵素と区別してプロテアソーム活性を特異的に測定したい，というのが目的です。 Suc-Leu-Leu-Val-Tyr-AMCがキモトリプシンの基質となり得るとすると，測定された活性は試料のプロテアソーム活性を特異的に示している，とは言えないのでは？　という疑問があります。 そもそも，プロテアソーム以外にも様々な蛋白分解酵素が共存している環境下で，プロテアソーム活性を特異的に示す事は難しいのでしょうか？ プロテアーゼ阻害剤カクテルを添加する事で，セリンプロテアーゼ，メタロプロテアーゼ等の影響は排除出来るかもしれませんが，そもそもこれらプロテアーゼ阻害剤がプロテアソーム活性に影響を与えないかどうかについても良く解りません。 他の皆様からの助言もお待ちしております。

(無題) 削除/引用 No.1084-4 - 2011/10/18 (火) 22:08:05 - う 確かプロテアソームって３つの酵素活性持ってますよね。 キモトリプシン活性とかなんちゃら活性とか。 ユビキチン分子自体はプロテアソームに引き寄せられるためだけのタグなので、in vitroでプロテアソーム活性を図りたいのであれば、ユビキチン分子は必要なく、基本的には酵素学なので、たとえばキモトリプシンの基質になり得るペプチドでいいんじゃないでしょうかね。

(無題) 削除/引用 No.1084-3 - 2011/10/18 (火) 19:41:25 - 指チキン mon様 コメントありがとうございます。 この基質は19Sによる認識を受けず，ダイレクトに20S内に送り込まれ，分解されるという事なのでしょうか。だとした場合，Suc-Leu-Leu-Val-Tyr-AMCという配列は他のプロテアーゼ等では分解されないという性質でないと，プロテアソーム特異的な活性を反映しない事になると思いますが，それが考慮された配列という事で良いのでしょうか？ 基本的な質問かもしれませんが，コメント頂けると幸いです。

(無題) 削除/引用 No.1084-2 - 2011/10/18 (火) 16:51:17 - mon 26Sプロテアソームと20Sプロテアソームの違いです。これを理解していないと間違った結論を導いてしまうかも。

プロテアソームの基質 削除/引用 No.1084-1 - 2011/10/18 (火) 16:18:22 - 指チキン プロテアソーム活性を測定したいと思い，調べてみると，Suc-Leu-Leu-Val-Tyr-AMCという物質が基質として一般的に使用されている様です。分解産物であるAMCの蛍光強度を測定するという，シンプルなものです。 ここで疑問なのですが，そもそもプロテアソームというのはユビキチン化された蛋白を分解する酵素だと思うのですが，前述の物質はユビキチン化蛋白ではありません。はたして，この基質で測定された活性が「特異的」にプロテアソーム活性を示しているといえるのでしょうか？ 高濃度EDTA条件下でアッセイしているので，カルパインの関与は除外できているかもしれません。また，セルライセートを試料とした時，プロテアソーム阻害剤でこの基質の分解が90%以上抑制される事は確認しています。 勉強不足かもしれませんが，ご教授頂けると幸いです。

全7件 ( 1 〜 7 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

パスワードを入力してチェックした記事を

チェックした記事を

このトピックにメッセージを投稿する 名前  メール  　アドレス非公開    タイトル  本文       設定  クッキーを保存（次回の入力の手間を省けます） 上に上げない（トピックの一覧で一番上に移動させません） 解決（問題が解決した際にチェックしてください） 暗証  半角英数字8-12文字の暗証番号を入れると、あとで削除、修正ができます。 送信

---

〔使い方〕 「アドレス非公開」をチェックすれば、自分のメールアドレスを公開しないで他の方からメールを受け取れます。 問題が解決した際には、解決ボタンをチェックして解決した旨のコメントをつけてください。これは、初めにトピックを作った人と管理人のみが可能です。 半角カタカナ、機種依存文字(全角ローマ数字、○の中の数字等)は文字化けの原因となりますので使わないでください。

---