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(無題) 削除/引用 No.1116-9 - 2011/10/27 (木) 10:19:06 - nana 皆様本当にありがとうございます。 qqさまのおっしゃられていた方法を用いて分離することができました。 様々な助言本当に感謝いたします。

(無題) 削除/引用 No.1116-8 - 2011/10/25 (火) 22:31:56 - qq 両端にマーカーと、それ以外の全レーンにサンプルをのせて、Native-PAGEで分離して、両端＋１サンプルレーンを切り、CBB染色します。切り出したい必要な部分を、染色していない部分から切り出します。抽出方法には、それなりの工夫が必要でしょう。

(無題) 削除/引用 No.1116-7 - 2011/10/25 (火) 15:40:05 - ~ >金銭等の理由から、できるだけキットを使用しないでできないかと考えていたのですが イメージがつかめないということでしたので、あくまで、原理の理解のためにはメーカー提供資料の原理図や操作例などを見るのが便利だという例として挙げました。 絵を見てイメージさえつかめれば、 http://www.scientistsolutions.com/a46-protocol-electroelution+of+proteins+from+sds_page+gels.aspx のようなプロトコルから、自分で実験系を組み立てることが出来るのではないでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.1116-6 - 2011/10/25 (火) 14:56:53 - mon Imidazole-Zinc Stainは、SDSを使いますので、多少なりともタンパクは変性しますね。 SDSを添加しない組成で染色できるかわかりません。原理的にはできそうですけど。 論文を探してみてください。 Harmoniaさんが指摘していますように、他のnegative stain法は（市販品でも）あったと思います。

(無題) 削除/引用 No.1116-5 - 2011/10/25 (火) 11:22:48 - nana 皆様さまざまなアドバイスありがとうございます。 Harmoniaさま >切り出して、何に使うつもりでしょうか？ 切り出し後、Pull-down assayに使用します。 ~さま 金銭等の理由から、できるだけキットを使用しないでできないかと考えていたのですが、やはりキットを使用するのが早そうですね。上司と相談してみます。参考になる資料ありがとうございます。 monさま できるだけタンパク質が非変性状態の物を使用したいので、SDS-PAGEではなくNative PAGEによる泳動にて切り出してきたいと考えているのですが、カウンターステイン法はNative PAGE Gelを染色できますでしょうか？

Imidazole-Zinc Stain 削除/引用 No.1116-4 - 2011/10/25 (火) 09:53:41 - mon ゲルが白濁する、カウンターステイン法の一つです。 バンドが薄白〜透明ですので、肉眼での定量性は今一でしたが、感度はCBBRより良好で、染色は早いです。ただし、SDS-PAGE gelの経験では、シャープなバンドにはならないことと、タンパクが多いところ（CBBRで見えるくらい）のバンドが重なると、バンドの判別は難しいのが欠点です。 (1)のwashを長目に、(2)をもう少し長目にすると良いかもしれません。 微量なときに、切り出してMS解析、westernblot前のlane間の比較等に、有効かなと思いました。 簡単な操作法を記します。 試薬： (I)10xImH/SDS: 2M Imidazole,1% SDS（fiter濾過が望ましい） (II)10xZn: 2M ZnSO4（fiter濾過が望ましい） (脱染色液）25mM Tris, 0.3M Glycine (pH8.0) SDS-PAGE Running bufferでも代用可 (1)SDS-PAGE gelをたっぷりのfresh DDW(溜め水はpHが低いのでNGらしい）でwash 30sec 2回 (2)1xImH/SDS(minigelなら100ml:もっと少なくても良さそう)に浸し、15分優しく振盪 (3)たっぷりのfresh DDW(溜め水はpHが低いのでNGらしい）でwash 30sec 1回 (4)1xZnに浸し、優しく振盪１分くらい。 タンパクのバンドは透明なまま、周囲のゲルが白く染まる！ やや染めすぎの方が、LASでのイメージングには良いようです。 (5)たっぷりのfresh DDW(溜め水はpHが低いのでNGらしい）でwash 1min 3回 (6)イメージをLAS1000・透過光モードなどで撮影する。 DDWを垂らした白色プレートに直にゲルを置いた方がきれいです。 FASの落射蛍光灯でも撮影できそう。 バンドを切り出して、タンパクを回収が可能です(脱染色が必要：詳しくは論文を参照）。 脱染色：western blotを行う場合、脱染色液で5min 2回以上振盪 たっぷりのDDWでwash 5min 3回(iBlotなら1回？〜不要か？？） 試薬は安価で、簡単です。ご参考になれば幸いです。

(無題) 削除/引用 No.1116-3 - 2011/10/25 (火) 09:32:53 - ~ >イメージができません。 プロトコルを読んでも何をやっているのかわからないということでしょうか？ http://www.wako-chem.co.jp/siyaku/info/life/pdf/gebaflextubepamphlet.pdf のような写真を見ると分かりやすいのではないでしょうか。 電気泳動層にゲルを入れたチューブをセットすると、ゲルからタンパク質が流れて、チューブ（自作であれば透析膜のバッグなど）内にトラップされます。 他の方法についても、メーカーのキットの説明書に書かれている絵を見ると理解しやすいかと思います。

(無題) 削除/引用 No.1116-2 - 2011/10/25 (火) 08:28:34 - Harmonia 切り出して、何に使うつもりでしょうか？ 染色手法として、CBBでタンパク質を染めるのでなく、銅化合物でゲルを染める（タンパク質があるところは染まらない）逆染色のキットがあったような？

Native PAGE Gelから切り出し 削除/引用 No.1116-1 - 2011/10/24 (月) 19:10:56 - nana いつも参考にさせていただいています。 現在Native PAGEを行い、染色しタンパク(12kDa前後)を切り出そうと考えています。 しかし、CBB染色で染色を行うと、CBBとタンパクが強固に結合してしまい、抽出できなくなるようで、他にどのような方法が用いることができるのか解らなくて質問させて頂きました。 また、切り出したあとのタンパク質のGelからの抽出方法が今一つ理解できていません。抽出方法としては、Gelを粉々に砕いて抽出する方法や、DNAの泳動槽を用いて泳動し、透析膜内に抽出する方法などがあるようですが、イメージができません。 手法等、ご存知な方がいらっしゃいましたらアドバイスをお願いいたします。

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