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皆様ありがとうございます。 削除/引用 No.1132-10 - 2011/10/28 (金) 18:52:29 - 初心者 >たとえば様 御助言ありがとうございます。その方法は比較的簡単にできますね。検討致します。 ＞カイ様 御助言ありがとうございます。おっしゃる通りだと思います。 今回はTOYOBOのPVDF blocking regentを使用しています。 抗体の付け方は、phosphoA-Ser○○、totalA、Thr○○でしたので、 ２回のストリップ後のメンブレンでは信頼性が低かったかもしれません。 （抗体の入手の関係でそうなってしまったのですが） まず最初にThr○○を少なくともつけて判断しなくてはダメですね。 ＞nanasin様 ご指摘ありがとうございます。それは入っています。Sigma phosphatase inhibitor cooktail２と３です。 以前、知らずに、入れずにやっていたことがありました。その際の結果はめちゃくちゃでした。 ＞ab様 有益な情報ありがとうございます。そのサイトはもちろん知りませんでした。 本当に初心者ですので、大変助かります。 SCのデーターシートでは綺麗な１本バンドということになっています。細胞はHUVECであり、 私の使用している細胞に近いです。 ＞Harmonia様 御助言、ご指摘ありがとうございます。 このような研究は私は全くの初心者ですので、大変参考になりました。 どこまで私の力でできるか難しいところですが、検討させて頂きます。

(無題) 削除/引用 No.1132-9 - 2011/10/28 (金) 08:20:09 - Harmonia そもそもの話になりますが、 ＞No.1132-3 - 2011/10/27 (木) 09:16:52 - nanasin ＞この実験で、一番重要なことはポジティブコントロールを用意することです。 これを正しく理解してください。もちろんネガコンも大事です。 マーカー無しで実験して、検出したバンドが検出したかったバンドであると言えますか？ 検出したい位置とその周辺に、まぎれもなく１種類しかものが無いなら、サイズをあてに議論できますが、何種類あるか（もしかしたら無い場合も含め）分からないのですから、サイズだけで議論するのはむちゃです。 その上でサイズの議論をするのであれば、「修飾をうけてサイズが変わるけど、思ったところには出なかったのね」と、納得できます。 リン酸化酵素の阻害剤有り無し、脱リン酸化酵素の添加有り無し、「ある刺激」有り無し、抗原ペプチドによる抗体阻害の有り無し、など、昔ながらの「時間がかかる面白みの無い」実験が大事です。 そのタンパク質のリン酸化酵素が分かっているなら、 Mol Cell. 2011 Oct 7;44(1):62-71 のように、大腸菌内でリン酸化タンパク質を発現させることも一考です。

(無題) 削除/引用 No.1132-8 - 2011/10/28 (金) 00:58:06 - ab もういろいろ調べていると思うのですが、Biocompareというサイトで一括して抗体を探せます。念のため。 あと、もし標的が違ったら申し訳ないのですが、BD Transduction Labに、目的のリン酸化部位特異的抗体はないでしょうか？ ちなみに、SCのデータシートでは、同じように非特異的なバンドは見えてますか？ いずれにしても、CSTの抗体で上手く検出できるといいですね。

(無題) 削除/引用 No.1132-7 - 2011/10/27 (木) 21:25:05 - nanasin 可溶化バッファーにホスファターゼ阻害剤は加えていますか？

(無題) 削除/引用 No.1132-6 - 2011/10/27 (木) 19:42:45 - カイ 同じメンブレンをストリップしてリン酸化タンパクを認識する抗体をかけるのはちょっと難しいかな、と思います。 ストリッピングでシグナルが多少薄くなる。 ストリッピングしても前回かけた抗体が残っていてマスクしている可能性。 さらに前回使ったブロッキング剤がミルクの場合、ミルクの中の脱リン酸化酵素によるメンブレン上での脱リン酸化。 そういう感じで、phosphoA (Thr○○）の本当のバンドが検出しづらかったのかもしれませんよ。

(無題) 削除/引用 No.1132-5 - 2011/10/27 (木) 19:42:35 - たとえば あと、A抗体のウエスタンをオーバーエクスポーズしてもそのバンドの「派生的な部分」とまったく一致しないといえるでしょうか？ これはたとえば、１％が異常シフトした場合、全体的なバンドではなく（それは一致しないようですが）、A抗体の１％の異常シフトシグナル（あれば）と一致しない、するという確認が必要だと思います(比較的簡単）。厳密に言えば。

ご回答ありがとうございます。 削除/引用 No.1132-4 - 2011/10/27 (木) 14:04:56 - 初心者 ＞たとえば様 ありがとうございます。ゲルの濃度を４％などでやってみてはと知人にもアドバイスを受けました。現在10-20％のグラディエントゲル（市販品）ですので。ただ、まさにおっしゃるとおり、totalAとの一致に関しては、同じ膜をストリッピングして使用してるのでわかりますが、これははっきりと「一致していない」ですので、多分ダメだと思います。phsphoA(Ser○○）はきっちり一致して、150kDマーカーの下にありますので、上に出ているのは非特異的バンドということですね。 おっしゃるとおり、IPなどで確かめることも重要かと思います。時間をみて検討致します。ご助言頂きありがとうございました。市販品ではもう１つしか抗体はありませんので、その抗体を購入してみて、うまく出ればよいのですが・・・。 ＞nanasin様 ありがとうございます。着色マーカーが少しズレがあるというのは存じておりました。ただ、上記の通り、あきらかにtotal Aとphospho A(Thr○○）のバンドは重ねても一致しておりませんので、リン酸化で若干分子量が上がっても、ここまでズレるとは思えず、おそらく非特異的バンドであると思われます。結果がreasonableなバンドに見えたため、希望的観測でした。。。 ちなみに、今やっている実験はそのものがポジコンのような実験で、すでに他の細胞ではっきりと出ることが確認されているものを検出しているため、バンドがズレる、出ていないということ自体が問題です。やはり抗体の問題のように思われました。

(無題) 削除/引用 No.1132-3 - 2011/10/27 (木) 09:16:52 - nanasin 着色マーカーは着色処理のため若干ずれが生じることがあるとメーカーから説明を受けた記憶があります。 メーカーのサポートに問い合わせてみてはいかがでしょうか。 この実験で、一番重要なことはポジティブコントロールを用意することです。

(無題) 削除/引用 No.1132-2 - 2011/10/27 (木) 07:36:20 - たとえば ゲルは目的のものが2/3くらいまで４％で流すと解像度があがるかもしれません。やってなければ。 そしてそのとき、トータルA抗体とそのリン酸化されたものが一致するかどうかみます。普通は一致しないとかなり怪しいと思います。 ただ、厳密にいえばわずかにリン酸化された蛋白がシフトし、認識されている可能性があります。そのときはさらにA抗体でIPしてそのあとウエスタンでバンドが検出されるかをみればいいと思います(ネガコンをとること）。濃縮効果があればそのときにリン酸化バンドがA抗体とリン酸化の抗体で検出できるかもしれません。

WBで目的蛋白の分子量のズレ 削除/引用 No.1132-1 - 2011/10/27 (木) 01:00:45 - 初心者 WB初心者です。適切な説明ができないかもしれません。ご容赦下さい。 現在、ある刺激によってある蛋白Aのリン酸化をみる実験をしております。 その蛋白の分子量は140kDで、total A、phospho A(Ser○○）はちょうど目的の分子量のところに バンドが出ており、非特異的バンドも少なく、正しいと思います。結果もreasonableです。 分子量マーカーはGEのレインボーマーカーを使用しており、150kD(赤）の下にbandが出ます。 一方、このメンブレンに、先日購入したphospho A (Thr○○）の抗体をつけると、 まだ条件がうまく決めれていないためか（Santa-Cruz製品で1:200からスタートと記載あり） 低分子量の非特異的バンドも多く、見にくいのですが、 150kDのマーカーのわずかに上にバンドが出ます。 このバンドの周りには非特異的バンドがほぼ無いので、このバンドは割とくっきり見え、 もしこれがtrue bandなら、結果としてはreasonableです。 しかし、分子量がやや違うところにバンドがあるため、これがtrue bandか確証が得られません。 140kDあたりにも、わずかにバンドがあるようにも見えなくも無いのですが、 相当薄いので、これが見えるように条件を変えると、おそらく非特異的バンドが更に増えて、 真っ黒なメンブレンになってしまいそうに思います。 このphospho A (Thr○○）のバンドとして、この150kDの若干上に出たバンドを true bandと考えることはできるのでしょうか？ 購入可能な抗体はSC以外だと、CSTのものしか無く、 こちらは反応種でHumanは( )付きのため、ヒト正常細胞を使うものとしては あまり期待できず、SC製品を買った経緯があります（参考文献あり） 諸先輩方、何卒ご教示宜しくお願い申し上げます。

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