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ありがとうございました 削除/引用 No.1149-26 - 2011/11/05 (土) 03:56:42 - 犬が西向けば尾は東 その後、借りた泳動槽で同じサンプルを今までと同じ泳動条件（ただしBSAは無し）で流してみました。借りてみたら、驚いたことに同じメーカーの同じ泳動槽でした。結果は、スマイリングは大幅に軽減されていました。が、完璧ではなく、その知り合いが見せてくれた泳動パターンに比べるとわずかにスマイリングしていました。aji様の仰る電極の部分をチェックしてみたところ、確かにうちの泳動槽のはグニャグニャ歪んでいて、借りたものは比較的真っ直ぐでした。間違ったふりをして自分のラボの泳動槽を代わりに返す・・・などということはせず(^^;)、知り合いの泳動条件を聞いてみたところ、私の泳動条件とほぼ変わりませんでしたが、使っているマーカーが違いました。うちはPerkinElmerの試供品、知り合いはBio-RadのDual Colorでした。マーカーの成分の違いか、あるいはマーカー自体のボリューム（二人ともlysis Bufferで他サンプルとボリュームを合わせていますが、私はマーカそのものは10ul、彼は5ul流していました）による違いが出たのかもしれません。 歪みを直してみたいとも思いますが、下手にいじって切れてしまうのも怖いですし、抗体一種類を使う分には申し分ない泳動パターンを示しますので、特に手をつけずにおこうと思っています。 知り合い曰く、いつも完璧に真っ直ぐになるわけではなく、今回の私の結果ぐらいのスマイリングはよく起こるということでした。 完璧では無いというものの、自分としては十分に満足がいくくらい真っ直ぐに流れましたので、もう一度二度別の実験に使ってみて、再現よく結果が得られればこの借りた泳動槽で本番サンプルを流そうと思っています。 皆様ありがとうございました。一応これで解決とさせて頂きますが、もし、今までに話にあがっていないtipsをご存じの方がおられれば、教えて頂ければ幸いです。

(無題) 削除/引用 No.1149-25 - 2011/11/04 (金) 09:36:54 - よっしー 低温室で泳動するのは如何でしょうか？ どれほど改善するかはわかりませんが・・・

(無題) 削除/引用 No.1149-24 - 2011/11/03 (木) 20:17:27 - カイ 熱に関していえば定電圧のほうが利点があるかと。 ミニゲル二枚ですが、定電圧120Vで一枚あたり30ｍM、二枚で60ｍMでスタートしても、終わる頃には二枚で10〜20ｍM程度に落ちるので、熱がそんなに出たことはないですね。 昔いたラボは定電流派だったので郷に入っては郷に従え、流儀を変えるのは難しいと思いますが。 ゆっくり熱が出ないように、はキモかと思います。

(無題) 削除/引用 No.1149-23 - 2011/11/03 (木) 14:56:46 - σσ 泳動槽当たり、ミニゲル２枚で60mA流すと熱が相当出ませんか？ 冷却バッファの量にもよりますが、ミニゲル泳動槽ということを考慮すると ２枚同時に流すことが出来るけれども１枚で我慢しかつ20mA程度が無難かと、、

グラジエントゲル 削除/引用 No.1149-22 - 2011/11/03 (木) 14:20:40 - aji 私はバイオラッドのグラジエントゲルを使ったことがないので確かなことは言えませんが、グラジエントゲルのため、下のほうが広がってるだけ、ということはないでしょうか。 メーカーのHPの写真に比べて明らかに広がっているのでしょうか。 泳動槽の中の電極が変に曲がってないことなども確かに重要です。これまでの経験上、古い泳動槽で変なゆがみが出る時は大抵電極が曲がっていました。

Pre-stained Marker 削除/引用 No.1149-21 - 2011/11/03 (木) 09:08:06 - mon ブロットの切断が目的なら、プレステインマーカーが目印にできます。具体的には、プレステインマーカーを試料間に流してブロットしマーカーレーン上を切断しています。場合によっては通常の分子量マーカーもその横に流しています。

(無題) 削除/引用 No.1149-20 - 2011/11/03 (木) 06:56:52 - ab 基本的にBioRadのミニプロテアンで、自作ゲルと自作バッファーを使ってますが、今のところきれいに流れています。 ふと思い出したのですが、以前とても古い泳動槽で白金線がくねくねしているものを使ったら、かなり泳動パターンが乱れました。 関係あるかわかりませんが、泳動槽依存的だということなので、ひょっとして。 あとは、サンプルのバッファーの組成（界面活性剤の濃度とか塩濃度とか）やサンプルの濃度の違いでスマイリングが起こったり、起こらなかったりしそうな気がします。

書き忘れてました 削除/引用 No.1149-19 - 2011/11/03 (木) 03:54:08 - 犬が西向けば尾は東 使っているReady Gelの大きさは、ゲル部分で10cm x 7cmになります。

現在使っている泳動槽について 削除/引用 No.1149-18 - 2011/11/03 (木) 01:07:48 - 犬が西向けば尾は東 泳動槽の名称はわかりませんが、Bio-Radの製品で、gel全体がタンクの中に沈むタイプで、前後両面にゲルを取り付けられるタイプの物です。 使用しているゲルは Bio-Rad、Ready gel (Tris-HCl, 4-20%、10 wells、各ウェルの最大ボリュームは50ul、片面はガラス、片面はプラスチックで出来ています） で、ゲル一枚あたり30mA定電流で泳動していました。サンプルのボリュームは10-30ulの間におさまる範囲でapplyしています。 （なお、私もカイ様と同じく特定装置を誹謗する意図はありません。今回の件までこの装置に特に不満を感じることもありませんでしたし） モモ様、カイ様の仰るように、特に新しいtipsを使ったわけでなくとも、泳動槽を変えただけで真っ直ぐ流れることがあるのですね。やはり、別の泳動槽を試してみようと思います。近くのラボで、きれいな泳動パターンを見せている知り合いに借りてみようと思います。 >お勧め様 今まで考えたことがなかったです。仰るとおりにバンドが近いのもありますが、遠い位置にあるのもあります（100kDa付近に数本、40kDa付近にも数本）。70kDaあたりでおおざっぱに二つに切り分けて、それぞれで混ぜ合わせた抗体で反応させるという手が使えるかもしれません。もちろん予備実験します。ありがとうございます。 >qq様 お気遣いありがりがとうございます。たしかにそういう点で揉める場合も無くはないですものね。今の先輩は大丈夫です。きちんと論理的に説明が出来れば、むしろそれは自分自身の勉強になるから、と言ってくれる良い先輩です。逆に、私が、BSAをブロッキングに使うのは良くてレーンに流れてあると良くない理由が説明出来ない点に、先輩から注文をつけられるだろうなと思います。 67kDa付近に目的タンパクが無かったので、今まで見過ごしていました。納得です。ありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.1149-17 - 2011/11/02 (水) 20:07:49 - カイ にぎやかなので私も参加させてください。 私もこの辺は興味あります。 過去いくつかのラボを移動して、そのたびに違う泳動装置を使ってきましたが、今のラボに移ってから使っている装置だとかなりきれいに流れるんです。 ウェルの大きさに対して多いサンプル量を流してもなんとかなる。 ただ理由が自分でもよくわからないので考察してみようかと。 (特定装置を誹謗する意図はないです。） A:　バイオラッド　ミニプロティアン ガラス板に自作ゲル。自作バッファー。Tris-Glycine B:　インビトロジェン　Nupage プレキャストゲル。市販バッファー（Tris-Glycine) C:　インビトロジェン プレキャストゲルと同じ形の使い捨てプラスチックゲル板に自作ゲル、自作バッファー（Tris-Glycine) AとCはゲルの組成もバッファーの組成も同じ。 バッファーを板の外側にも多く入れるとか、使わないウェルにもサンプルバッファーを等量入れるとか、電圧は同じ条件です。 私は定電圧(120V）で流しますが電流は一枚ゲルで30ｍAくらいからスタートでだんだん減ります。 プラスチックゲル板が熱をよく放出してくれるのがいいのかなと考えていますが。 Bのラボで市販ゲルを使っていたときはだいたいOKなんですがたまに低分子が乱れたりしてました。バッファーの組成も違うし比較は困難ですけどね。

(無題) 削除/引用 No.1149-16 - 2011/11/02 (水) 19:39:51 - こうじ ゲルサイズを大きくする 低電流（電圧）でながす コームサイズに合ったタンパク質量をローディングする が基本だと思うのですが、 ゲルサイズ（縦ｘ横ｘ厚さ）はどれぐらいですか？ ゲルは自作ですか？ 低電流って何mAですか？ コームサイズは１ウェルのサイズ（縦ｘ横）は何mmx何mmですか？ 応用的に違う泳動槽やゲルを使うというのがありますが どこのメーカーのどういった泳動槽を使われているのでしょうか？ ここら辺の情報が欲しいです

(無題) 削除/引用 No.1149-15 - 2011/11/02 (水) 13:39:24 - モモ ＞モモ様、その泳動槽やゲル以外を使った時にはスマイリングを経験されましたか？ 私の腕でバイオラドのミニゲルと比べると、泳動距離が２倍近くに伸びる一方スマイリングは３分の１ぐらいに減る感じでした。恐らく構造的にゲルの側方へのリークが少ないのだと思っています。

(無題) 削除/引用 No.1149-14 - 2011/11/02 (水) 07:06:52 - お勧め まあ、スマイリングが気になるほど２つもしくはそれ以上のバンドｓが近接しているということでしょうけど、わたしなら、2種の抗体を混ぜますね。もちろん相互に干渉しない、いい抗体でなければいけません。その場合はお勧めです。

(無題) 削除/引用 No.1149-13 - 2011/11/02 (水) 06:33:45 - さんか ちょっと楽しそうなので参加してみます。 スマイリング： a.低温室でやるといいって言っておられる方がおられました。 b.プレキャストのゲルだと、ある程度最適化されてるはずなので、販売元のマニュアル通りの流し方をするのが良い（ゆっくり流しすぎない）と言っておられる方がおられました c.験担ぎでいつもと違う実験台で流してみるのはどうでしょうか。 10ugのBSAでサンプルのバンドが歪む可能性: やってみた事がないので知りませんが、10ugがまとまって流れているサンプルと10ugがバラバラに流れているサンプルじゃトータルの電気抵抗？は同じくらいかも知れませんが、局所的には全然条件が揃ってないってことを考えているんじゃないでしょうか？

引き続きありがとうございます 削除/引用 No.1149-12 - 2011/11/02 (水) 04:49:05 - 犬が西向けば尾は東 >ab様 使っている泳動槽はゲル全体が浸かるタイプですが、なぜかうまくいかないんです。もっとも、メンブレンを切る必要が無い場合には、特に問題となるほどのスマイリングでも無いのですが。 その後、空きレーン及びマーカーレーンにBSAを入れずに泳動してみました。特に改善が見られはしませんでしたが、改悪にもなりませんでした。 この時に気づいたことがあります。うちのラボには同じメーカーの同じ型の泳動槽が二つあり、今回実験の都合でこの二つを使って同じメンブレンを4枚作ったところ、スマイリングのパターンがそれぞれで微妙に違いました。以前にも同様の作業で同じメンブレンを4枚作ったことがあり、この8枚のマーカーレーンの流れ具合をよく見比べたところ、どうも泳動槽依存的にスマイリングのパターンが決まっているよう（パターン4種類それぞれで2ペアが出来たので）です。別の泳動槽で試すのが一番手っ取り早いのかもしれません。現在外国にいるので、page様がコメントして下さった日本エイドーの製品が試せないのが残念です。 >qq様（掲示板からの返信で失礼します） 「10ugのBSAでサンプルのバンドが歪む可能性」があると考えられる理由はなんでしょうか？BSAを入れて各レーンでのタンパク量を合わせたのは、それぞれのレーンでの電気抵抗が出来る限り等しくなるようにと考えてのことだと先輩から教えられ、私もその考え方に同意するので入れてみたのですが、この為に隣のレーンのバンドが歪む可能性についてはちょっと想像が付きません。 また、ブロッキングにBSAを使うことは問題無いが、レーンにBSAを入れるのは問題がある、というのも、理由がわかりません。もちろん、BSAをどうしても入れたいという訳ではないのですが、後学のため教えて頂けると幸いです。

(無題) 削除/引用 No.1149-11 - 2011/11/01 (火) 07:18:31 - ab どのような泳動槽を使っていますか？ 上下にバッファータンクがあるものだと、DNAでもタンパク質でも泳動が乱れることがよくあります。 BioRadとかInvitrogenとかのゲル全体が浸かるタイプだと、数レーンしか使わなくても、今のところスマイリングしたことはありません。 ちなみに、定電圧200Vでやってます。 あと、タンパク質量が多すぎると、左右に広がっていくので泳動の乱れの原因になることもあります。 ご参考までに。

皆様コメントありがとうございます 削除/引用 No.1149-10 - 2011/11/01 (火) 04:18:42 - 犬が西向けば尾は東 空きレーン、マーカーレーンのボリューム調節には、サンプル調整時に使ったlysis bufferを使っております。 BSAの追加（空きレーンにもサンプルと同量のタンパク濃度で入れています）に関しては、必要ないということでしょうか？BSAを入れる必要はない、ボリュームが合っているのであればタンパク量を合わせる必要は無い、ということであればいちいちBSAを入れる手間が省けて楽になります。次回はBSAを入れずにやってみます。 >qq様 問題とは、抗体がBSAレーンに優先的に反応して、サンプルの方に反応する量が少なくなるということでしょうか？個人的にはそのような事態は起こりづらいように思いますが、経験がないのでわかりません。 確かにもう一枚泳動するのが一番手っ取り早いのですが、本番（という言い方で良いのか）のサンプルは、共同研究先で作ってもらうサンプルで、非常に少ない量しかありません。作成に非常に手間のかかるサンプルで、各レーン10ug流すとして泳動二回分以上は難しい（細胞はいくらでもあるが、ふりかける試薬の量が限られている）と言われているので、このような相談をさせて頂くことになりました。 ポンソー染色は良いアイデアだと思うのですが、見たい抗体の一つで、なぜかポンソー染色で明らかにバンドの減衰が見られるので、出来るならポンソー染色は避けたいと思っております。 泳動槽やゲルを変えるというのもありなのですね。220V様、モモ様、その泳動槽やゲル以外を使った時にはスマイリングを経験されましたか？ Harmonia様、私の経験するスマイリングについてですが、ウェルを左端から順に1、2、3、・・・、9、10とすると、中央の4、5、6は水平から直角90度で真っ直ぐ下に流れていくのが、1では88度、2では89度、9では91度、10では92度の角度で流れていくという感じで、全レーンで真っ直ぐ真下に流れていってはいません。 TS様、温度上昇を防いでスマイリングを軽減する、も次回試してみます。 皆様、コメントありがとうございました。アドバイスを元にもう少し試行錯誤を繰り返してみようと思います。

(無題) 削除/引用 No.1149-9 - 2011/10/30 (日) 18:29:18 - TS 今回の対策に有効かどうかわかりませんが、 バイオラッドの人が外側の泳動バッファーの量を増やすと温度が上がりにくく、泳動がきれいになりやすい、と言っていました。 わたしも温度が上がりやすい泳動条件の時、バッファー量を増やしたり、 氷冷しながら流したりしますが(スターラー使用)、たしかに温度上昇による乱れは軽減できているような気がします。 対策案の1つとして。

(無題) 削除/引用 No.1149-8 - 2011/10/29 (土) 19:25:27 - モモ バイオラドのクライテリオンはかなり真っ直ぐ流れますよ。 泳動距離も長いのでメンブレンをサイズで切り分けるのも簡単です。

(無題) 削除/引用 No.1149-7 - 2011/10/29 (土) 15:11:16 - Harmonia Ponceau Sです。 モノクロ抗体のスクリーニングはバイオクラフトの２４レーンのミニゲルに抗原を泳動し、転写後メンブレンをPonceau Sで染色して切り分けました。 見えるので、空レーンは作っていません。 ちょっと気になるので、確認ですが、スマイリングって、ゲルの中央のレーンと端のレーンで、サンプルの移動度が異なることですよね？ レーンごとに見れば、 ＞アガロースゲルにDNAやRNAを泳動した時のように上から下まで真っ直ぐに泳動 は、できていますよね？

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