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(無題) 削除/引用 No.121-13 - 2011/03/09 (水) 03:59:54 - おお 後でシーケンスという手間がありますが、全長をPCRしてしまう手はありますね。

ありがとうございます。 削除/引用 No.121-12 - 2011/03/08 (火) 20:26:00 - メリーさん おお様 貴重な情報をありがとうございます。 昨日、DH5aに形質転換したものは、やはり２４時間たっても 全くコロニーは生えてきませんでした。 全くKm耐性遺伝子が発現してないか、実用以下の量だと考えられます。 今回は、事情のため遺伝子をpCDNA3.1に組み替え直しておりますが、 皆様からのアドバイスは今後に生かしていきたいと思います。 ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.121-11 - 2011/03/07 (月) 22:16:29 - おお >[Re:10] メリーさんさんは書きました : > > おお様、お調べ頂き感謝致します。 > > 確かに、Km(R)+ Amp(R)-amber Tet(R)-amberの60kbpのプラスミドを > TOP10やMC1061に入れているとの記述もあるので、この菌でKanamycinの > セレクションはかけられないですね。 > ところで、この薬剤耐性用のプラスミドは、pCDNAI/NEOのミニプレップでは > 無視できる位にしか混ざらないのでしょうか。 > 数百ナノグラムのっけて、はっきりとしたバンドがかろうじて見えるけど5%以下(きっとそれよりもっと低い)って感じです。

ありがとうございます。 削除/引用 No.121-10 - 2011/03/07 (月) 17:23:51 - メリーさん おお様、お調べ頂き感謝致します。 確かに、Km(R)+ Amp(R)-amber Tet(R)-amberの60kbpのプラスミドを TOP10やMC1061に入れているとの記述もあるので、この菌でKanamycinの セレクションはかけられないですね。 ところで、この薬剤耐性用のプラスミドは、pCDNAI/NEOのミニプレップでは 無視できる位にしか混ざらないのでしょうか。 ats様　ありがとうございます。 >NPT2=neomycin phosphotransferase II 納得しました。 よく考えればそのままですね。 今度はもう少しちゃんと調べてから質問させて頂きます。 今日、Vectorを変えるための大腸菌の形質転換をしたついでに、 15ug/ml Kmの薄い濃度で(いつもは50ug/ml)、pCDNAI/Neoを DH5aに入れてみました。 また、ご報告致します。 ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.121-9 - 2011/03/07 (月) 15:21:54 - ats NPT2=neomycin phosphotransferase IIですので、本来のKn耐性遺伝子のpromoter+CDSが組み込まれているのでいるのでしょう。 NPT2の場合、CDS本来のATGの上流にframeがずれたATGコドンがあり、(大腸菌では問題ないが）培養細胞の場合はそれを取り除いた方がG418耐性クローンが多くとれる、という論文を読んだことがあります（NPT1かもしれない）。

(無題) 削除/引用 No.121-8 - 2011/03/07 (月) 15:13:05 - おお Low yields are common : pCDNA1/Neo expresses kanamycin resistance very weakly and the plasmid usually forms dimers which run very high on the gel. Also, the plasmid is grown in MC1061/P3 cells, and the residual P3 plasmid itself is kanamycin resistant, and will transform alone. Individual colonies should be picked and checked. http://docs.google.com/viewer?a=v&q=cache:00ifEMT7RY0J:tools.invitrogen.com/content/sfs/productnotes/F_071215_MammalianExpressionVectors.pdf+Neo/Kan+em+promoter&hl=en&gl=us&pid=bl&srcid=ADGEESiwleTAfd5aosf4ZtRCpm5-g66_ZwWdL-3mg16VTtqv6C_AXzmKMtrRbhQJIPjMlaw-nRzAgyfSKwO8V-fhAYt_7ksWGboTyHf43SFwGJf3OfFr2CY6_aCJd5fC6qgKtZ1jbOsN&sig=AHIEtbRZ_s16eJkpkGniUopPj09Rg2wP1g P3エピソーム自身がカナマイシン耐性で邪魔になるそうです。

解決致しました。 削除/引用 No.121-7 - 2011/03/07 (月) 15:08:29 - メリーさん テクニカルサービスに問い合わせたところ、 おお様の仰るようにP3導入株が必要との回答でした。 研究室にこのタイプの菌体がないので、年度末ということもあり 購入も難しいので、遺伝子を他のベクターに移そうと思います。 ありがとうございました。

ありがとうございます。 削除/引用 No.121-6 - 2011/03/07 (月) 14:44:25 - メリーさん おお様 丁寧に教えて頂き、ありがとうございます。 実は、Lablife(下記)を検索していてpCDNA1/NEOは、Km耐性であるとの表記がありました。 https://www.lablife.org/g?a=seqa&id=vdb_g2.3kPf0S7dkoH7UbPvcNbolXH123o-_sequence_ffb19f70a55f8c7abb0268be4d2c89b80401b8df_10 単なる機械的なアノテーションのミスかと思いましたが、 Kmプロモーターとして下記の配列が示されており、 CCGGAATTGCCAGCTGGGGCGCCCTCTGGTAAGGTTGGGAAGCCCTGCAA どうやらNPT2 Promoterなるものでした。 良く使用されるのは、Amp(R)のベータラクタマーゼプロモーターかと思います が、pNPT2は細菌由来のものかは、それらしい表記はあるのですが、 はっきりは解りませんでした。どなたかNPT2 promoterについて御存じの方が おられれば、教えて頂けないでしょうか。 宜しく御願い致します。

(無題) 削除/引用 No.121-5 - 2011/03/07 (月) 14:05:44 - おお >[Re:1] メリーさんさんは書きました : > 自分で検索したところでは、Kan/Neoの上流にバクテリアプロモーター > があるかはっきりしませんでした。 明記されてないのでないと思います。遺伝子表記もKan/Neoになってませんので。

(無題) 削除/引用 No.121-4 - 2011/03/07 (月) 14:02:32 - おお このプラスミドは使ったことがありませんが、これのひとつ前のバージョンでpCDM8というのがありそれもsupF/P3のコンビネーションでセレクションがかかるようになっています。マップを見る限りバクテリアの薬剤耐性は直接乗っていないですし、supFを入れる理由はほかの薬剤耐性遺伝子を入れるより短くてすみ、プラスミドを無駄にでかくしないための工夫なので、両方が共存しているマンマルなどの発現ベクターはあまりないかと思えます。 P3エピソームなどが入った大腸菌を使うべきだと思います。 >[Re:2] メリーさんさんは書きました : > 「とりあえず形質転換してみれば」とおっしゃる方も 無駄になる可能性が高いのでそうは申し上げられません。

すみません。途中で切れました。 削除/引用 No.121-2 - 2011/03/07 (月) 13:24:58 - メリーさん 「とりあえず形質転換してみれば」とおっしゃる方も 多いと思いますが、このベクターを使用した事がある方が おられましたら、お教えください。 宜しく御願い致します。

pCDNA1/NEOの増幅 削除/引用 No.121-1 - 2011/03/07 (月) 13:22:56 - メリーさん 御存じの方がいれば教えて頂ければと思います。 InvitorgenのpCDNA1/NEO http://www.invitrogen.com/search/global/searchAction.action?query=pcDNAI-neo&resultPage=1&resultsPerPage=15&x=0&y=0 というベクターに目的の遺伝子が入ったプラスミドを供与して頂いたの ですが、プラスミド増幅用の宿主、薬剤等について迷っております。 マップを見る限り、Kan/Neoがバクテリアプロモーターに繋がっていれば カナマイシンと普通のDH5aのような宿主で増幅できると思うのですが、 そうでなければ、SupFを使って、 TOP10/P, MC1061/P3 http://www.invitrogen.jp/catalogue/invitrogen/C5050-03_001.shtml のような宿主でAmp(amber), Tet(amber)で選択しなければなりません。 自分で検索したところでは、Kan/Neoの上流にバクテリアプロモーター があるかはっきりしませんでした。 「とりあえず形質転換してみれば」と 基本的な質問で申し訳ありません。

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