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self-ligationすれば 削除/引用 No.1234-5 - 2011/11/24 (木) 17:06:21 - mon 制限酵素処理後のPCR産物をself-ligationすれば、制限酵素処理の良否は判定できます。 つまりラダーや高分子量バンドが見られるようなら、PCR産物の制限酵素処理は成功しています。 ２倍長のみで終わっていれば、DNA末端の片方だけ切断されていることになります。 SfiIのような切断末端が特殊な制限酵素だとダメです。

(無題) 削除/引用 No.1234-4 - 2011/11/23 (水) 23:19:33 - シリウス ＞PCR産物とベクターを制限酵素処理して、ライゲーションしてトランスフォーメションしました。 これまでの回答にもあるように、トピ主さんのPCR産物が、きちんと制限酵素処理されるものなのか（制限酵素の足場となる塩基があるかどうか）、不明なので、違った視点で一言・・・ PCR産物を直接、クローニングベクターに入れて、その後に、制限酵素処理してインサートを切り出したらどうでしょうか？ このインサートを使った方が、ライゲーションがうまくいくような気がします（私の拙い経験則ですが・・・）。 お役に立てば、幸いです。

(無題) 削除/引用 No.1234-3 - 2011/11/21 (月) 21:25:44 - qq 当然、何か原因があるのです。 あなたの質問では答えられません。 回答を得るためには、 １）制限酵素の名前と処理方法が必要です。 ２）PCR産物の制限酵素部位の両端からの距離が必要です。 これらの違いで、結果が変わります。 いずれにしても、コントロールとして制限酵素で切断したベクタだけのライゲーションを同時に進める方が結果を解釈しやすいです。 目的の断片が入っていなかったことに間違いないのでしょうか？ 方法は、ミニプレップして、制限酵素切断で確認したのでしょうか、それともコロニーPCRですか？コロピーなら、何のプライマーでPCRしたのですか？

(無題) 削除/引用 No.1234-2 - 2011/11/21 (月) 14:29:48 - KY うまくいけばコロニーは100個以上見えますが、プラスミドとPCR産物の長さなどにもよりけりです。 原因は様々なことが考えられます。 １、制限酵素処理がうまくいっていない。 ２、実は酵素を間違った。 ３、PCR産物末端の酵素サイトが切れていない。 ４、実は酵素がヘタっている。 ５、PCR産物が実は偽物だった。 ６、大腸菌の薬剤耐性を間違ってしまった。 ７、ホントはコンピテントセルでない大腸菌だった。 などなど、いろいろな推測ができます。 初心者であれば、まずはポジコンがちゃんとできるかどうかやってみましょう。 もしやっているのであれば、ちゃんと教えてくれないと、何ができていないのか無駄な推測ばかりしてしまいます。

サブクローニング 削除/引用 No.1234-1 - 2011/11/21 (月) 09:07:53 - tora 現在、あるベクターにサブクローニングしようと思っています。 PCR産物とベクターを制限酵素処理して、ライゲーションしてトランスフォーメションしました。 因にベクターには脱リン酸化処理して、PCR産物とベクターのモル比は3:1にしてあります。 コロニーの数が１桁程度しか現れず、さらに目的の断片が入ってませんでした。 初心者なので、あまりよくわかってないので、教えてもらいたいんですが、 サブクローニングの際はコロニーの数がこの程度なのか、 または何か原因が考えられるのでしょうか？

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