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シリウスさんありがとうございます 削除/引用 No.1249-10 - 2011/11/27 (日) 13:29:18 - Va やったときには70%くらいでした｡ちょっと多いなとは思ったのですが生き残る細胞がいれば増やせばいいやくらいな軽い気持ちでやったのであまりちゃんとした(気合いの入った)実験じゃなかったです・・・｡そういうのよくないですね｡ 重ね重ねのコメントありがとうございました｡

(無題) 削除/引用 No.1249-8 - 2011/11/25 (金) 15:51:17 - シリウス ＞導入効率が悪いのかセレクションをかけてずいぶん細胞が死ぬので、生き残っているものの変化に気がつかなかっただけかもしれません ウィルスのタイターが低い可能性もありますが、infection時の細胞密度は大丈夫でしょうか？ ご存知かもしれませんが、分裂期（即ち、核膜が消失している時期）の細胞でないと、レトロウィルスの遺伝子がゲノムに組み込まれないので、セレクションで死ぬ細胞が増えます。 私は、50〜70％コンフルエントの状態のときに、ウィルスを処理しています（あまりにも少ないと、処理したあとの増殖が悪いときがありますので）。 お役に立てば、幸いです。

シリウスさんありがとうございます 削除/引用 No.1249-7 - 2011/11/25 (金) 13:43:20 - Va レトロウィルスです｡ 処理翌日はそれほどおかしい感じはしなかったですし、セレクションを始めた最初の数日もおかしさは感じなかったので(導入効率が悪いのかセレクションをかけてずいぶん細胞が死ぬので、生き残っているものの変化に気がつかなかっただけかもしれません)ウィスル粒子の毒性の可能性は考えていませんでした｡ 貴重な経験談をありがとうございました｡GFP、RFPだとダメージを与えることがあるんですね｡ 今回の私の細胞は過剰なタンパクそのものが何か悪さをしていると考えるのがよさそうな気がしてきました｡

(無題) 削除/引用 No.1249-6 - 2011/11/23 (水) 23:07:23 - シリウス 使っているのは、レトロウィルスでしょうか？ あるタンパク質にHA、FLAG、myc、GFPをそれぞれ融合させたものをレトロウィルスでHEK293に発現させたとき、FLAG融合タンパク質を発現させた細胞のみダメージを受けたことがあります。 この原因は、ウィルス粒子の毒性だったらしく、2倍にウィルスを希釈したら、成功しました。 ちなみに、FLAGタグがいけないということではなく、他のタンパク質では、このような経験はありません。 また、レトロウィルス処理で、処理翌日に細胞が著しいダメージを受けたのは、これがはじめてでした（アデノウィルスでしたら、しょっちゅう経験していますが）。 トピ主さんがうまくいかない原因のひとつとして、ウィルスの毒性が考えられますが、どうでしょうか？ また、タグについて、気にされているようですが、私の場合、HA、FLAG、mycを融合させて困った経験はありません。 ただ、GFPの場合、融合させるタンパク質の種類によって、細胞が死にやすくなったりしました。 RFPの場合は、GFPよりも、もっとダメージを受けました。 トピ主さんへの回答になっていないかもしれませんが、お役にたてば、幸いです。

ありがとうございます 削除/引用 No.1249-5 - 2011/11/23 (水) 22:35:30 - Va ＞cuさん 何でかを解明するにはcuさんのおっしゃるとおりですね｡ 1回のtransfectionの細胞でも使えることは使えるので(その後の実験で、 もう少しHAが多いといいなぁと思ってやってみたことでした)、おそらくそういう実験はしないと思うのですが、ありがとうございました｡ ＞ABZOさん 普通に考えると過剰発現させたタンパクが原因ってことになるのでしょうね｡私も最初はそれが原因だと思ったので｡ HAの方が原因だったという話はないみたいですね｡ クローニングの時にいろんな発現のレベルのものを、というのはおっしゃるとおりです｡今回使ったベクターは貰ってきたものをそのまま使っていたので2回transfection、というやり方をとってみました｡ 細胞が死ぬのは抗生剤抜きのmediaに変えても同じなので導入したものが抜けているのが原因ではないみたいです。 ありがとうございました｡ ＞みさん ありがとうございます｡ウィルスベクターです｡ GFPの話を聞いたときに、もともと生体内にないものだからそういうこともあり得るのかも？、と思ったのですが、みなさんのお話を伺っているとHAではなく目的のタンパクが、と考えるのが自然みたいですね｡ 細胞の種類によってはウィルスベクターで上手くいきにくいというのは、導入が上手くいかないことがあるという感じに捉えていたのですが、タンパクが導入されたあともウィルスベクター自体が原因で何か上手くいかないことがあるということでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.1249-4 - 2011/11/23 (水) 13:44:03 - み transductionとかpolybreneなどの言葉が出てきていますが、ウイルスベクターでの過剰発現でしょうか？ また宿主細胞の種類によってはウイルスベクターで上手くいきにくいものもあるでしょう。 基本的にHA-tagが悪さをしているようには思えない。

(無題) 削除/引用 No.1249-3 - 2011/11/23 (水) 02:49:00 - ABZO HA-tagつけた蛋白質を発現させるのはふつうにみんなやってるし、それ自体が死ぬ原因でないような気がする。わかんないけど。ていうかやっぱその蛋白質が多いと細胞に都合悪いのか、それかミスホールディングして凝集とかして、ERストレスとかそっち系の経路が変な感じではたらいてそれで死んでるんじゃないかな。そういうのって何かアポットーシスとかなるでしょ。 やっぱ扱いに困る蛋白質の変な固まりができちゃうと細胞もかなり大変らしいよ。 ステーブルつくるとかの時とか、クローニングのとき発現レベルの異なるクローン多めにいくつかとって、そのなかでほどほどというか、ちょうどいい感じの発現（ウェスタンとかで見て内在性のものと同じくらいかそれ以下のレベルの発現）のやつを選ぶとかしてたけど、そういう風にしたらどう。過剰発現はいろいろあって、変に過剰発現のクローンとか使ってしまうと、出てくるデータが何見てるか分からなくなる危険性があってヤバいと先生が言ってたので、だるかったけど我慢してここは結構慎重にやってた。 あと、抗生剤で選抜かけながら継代してもちゃんと発現は続いてるのは確認してる？トランスフェクションしたあと始めだけ発現強くても、継代とともに、もしか薬剤耐性遺伝子ごと抜けてるとかない？それで死んでるとか、そういうのとはとは違う？

(無題) 削除/引用 No.1249-2 - 2011/11/23 (水) 02:16:30 - cu 1) HAのみで発現させてどうか 2) 目的タンパクを別のタグとつけて発現させてどうか というところじゃないでしょうか？ 今死んでしまう細胞はどうせ使えないでしょうから、手を動かすのが早そうですね

過剰のHA　ｔａｇで細胞が死ぬ？ 削除/引用 No.1249-1 - 2011/11/23 (水) 02:02:34 - Va とあるタンパクを培養細胞でoverexpressionさせて使っているのですが、そのタンパクにはHA-tagを付けています。 1回のtrunsduction(polybreneを使っています)では十分なHAの発現が得られなかったので、2回trunsductionしてwestern(抗HA抗体)で確認したところ、かなりの量のHAが発現していることがわかりました。 抗生剤でセレクションをして何回か継代をして早速その細胞を使おうとしたのですが、どうやらその細胞は弱くてすぐに死んでしまうのです。継代後、増えることは増えるのですが、すぐにボロボロになり分解されてしまいます。ちょっとわかりにくい例えかもしれませんが、洗いが足りなかったpoly-lysineコーティングの上で培養したときのような感じです。1回のみのtrunsductionでは、細胞は普通に培養している限りoverexpressionしていない細胞と動態に著明な変化はありません。 目的のタンパクが過剰なのが原因なのかとも思いましたが、増えたところでtoxicになるようなタイプのタンパクじゃないような感じで(もちろんその可能性は否定できませんが)、そんなときに、あるタンパク+GFPを骨格筋で過剰発現させるときに、発現が多すぎるとGFPのみのコントロールの方で骨格筋が萎縮してしまうことがあったということを聞いて、HAでも同じようなことが起こるのかも？と思いました。 このような現象を経験された方いらっしゃいますか？ そのほかにも何かヒントになるようなことをご教示願えたら幸いです。

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