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(無題) 削除/引用 No.1272-8 - 2011/11/30 (水) 18:26:37 - mon 失礼しました。 月詠さんが表記してくださっていますが、 OD600=1のときに、1x10^9cells/ml（XL1blue, 37℃培養）です。 菌株によって多少異なるそうです。 また、OD600と菌体数が比例するのは、OD<0.6~0.7のようです。 これ以上の値の場合は希釈して測定してください。 培地のOD600への影響は菌体数に関する限り誤差10%以下なので、DDWで希釈してもよいです。 なお上記OD600=1も希釈して測定した値を使った計算値です。

簡単な予備試験で確認できますよ？ 削除/引用 No.1272-7 - 2011/11/30 (水) 14:04:44 - 月詠 10μlのPCR反応系に加える培養液の量が ・多すぎるとPCR反応が阻害されて偽陰性（鋳型はあるのに非検出）に 　なりますし、 ・少なすぎると鋳型不足で偽陰性（＝検出感度以下） 　になってしまいますよね わたしの経験的に、PCRの反応系に菌を10の3〜4乗個加えれば、 多少反応効率が抑制されたとしても30サイクル程度まわせば ほぼ確実に（電気泳動で）検出できるはずです でもお使いのPCRの酵素や反応系や機器も違いますので、 ルーチンのアッセイ系として採用されるおつもりでしたら、 一応、ご自分でも （１）鋳型となる大腸菌が何個あると何サイクルで確実に検出できるのか、 （２）培地の持ち込みがどの程度になると反応系が機能しなくなるのか、 予備試験で確認されてみてはいかがですか？ 定常期まで培養した大腸菌培養液中に、菌が10の9乗個/mlの オーダーで存在しているとして、培地を純水で１０倍づつ 段階希釈した希釈系列を作成して、１μlづつ反応液に加えて PCRするだけです （培地原液を1μl加えると、反応系には10の6乗個の菌（鋳型）が 入りますので、培養原液を100〜1000倍希釈しても十分検出できる と思います） 原理的には、「検出感度以上の鋳型が含まれていて、かつ、 他の反応に不必要な成分（潜在的な反応阻害因子）は可能な 限り少ない方が好ましい」 わけですから、培養液をそのまま加えるのは、少なくとも より好ましい条件とはいえないでしょうね 希釈操作の手間を省略したいお気持ちは大変よくわかりますけど、 従来法を新しい手技に変更する場合には、従来法と比較実験して、 その方法の信頼性等を十分に吟味する慎重さが必要だと思いますよ？

(無題) 削除/引用 No.1272-6 - 2011/11/30 (水) 12:05:46 - sb >KYさん ありがとうございます。 PCR反応液の1/50 - 1/25くらいのボリュームですね。 培地のNaCl・tryptone・yeast extractが干渉して PCRが正常に起きないと思いましたが、 意外と出きてしまうものなのですね。

(無題) 削除/引用 No.1272-5 - 2011/11/30 (水) 10:43:16 - KY やったことあります。 10ulのPCR反応液に0.2-0.4ulぐらいの大腸菌培養液を加えてました。

(無題) 削除/引用 No.1272-4 - 2011/11/30 (水) 10:37:56 - sb >だいちょうさん 回答ありがとうございます。 PCR反応液の1/10以下ですね。 参考にさせていただきます。 >monさん >「培地中に懸濁された菌体を鋳型に用いたPCR」が可能か否かですよね？ その通りです。失礼しました。当方の書き方が不適切です。 ＞DDWで1/100ほど希釈して1uLほどをPCR反応液に加える >寒天培地上のコロニーをつついて直にPCR反応液に加えることも可能 アドバイスありがとうございます。 参考にさせていただきます。 >OD600=1のときに10の9乗細胞ほど含まれています なるほど。1uL中ということでしょうか？ >どちらも大腸菌数を考えれば、簡単なことです。 適性菌数の目安はありますか？

(無題) 削除/引用 No.1272-3 - 2011/11/30 (水) 10:03:31 - mon ＞「液体」培地からコロニーPCRしたい場合、 意味不明です。 質問は、「培地中に懸濁された菌体を鋳型に用いたPCR」が可能か否かですよね？ 可能ですが、持ち込みが多いとPCRを阻害します。 濁るほど菌が増えているのなら、DDWで1/100ほど希釈して1uLほどをPCR反応液に加えるとよいでしょう。ちなみに大腸菌では0D600=1のときに10の９乗細胞ほど含まれています。 また、「コロニーPCR」も、寒天培地上のコロニーをつついて直にPCR反応液に加えることも可能です。ただし、菌体を入れすぎ濁りが見えると失敗しますので、ラボではDDWに懸濁することを勧めています。 どちらも大腸菌数を考えれば、簡単なことです。

(無題) 削除/引用 No.1272-2 - 2011/11/30 (水) 10:02:52 - だいちょう 少なくともPCR反応液の1/10以下なら確実にできます。

液体培地からコロニーPCRできますか？ 削除/引用 No.1272-1 - 2011/11/30 (水) 09:49:35 - sb 通常、大腸菌をコロニーPCRする時は、 寒天培地上のコロニーをつついて milliQに懸濁した後に PCR反応液を調整すると思います。 「液体」培地からコロニーPCRしたい場合、 培地をそのまま加えてもPCR可でしょうか？ それとも、遠心してmilliQに懸濁しなおしたほう確実でしょうか？ 基礎的な部分になってしまいますが、 ご教示お願いいたします。

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