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~ さん 削除/引用 No.1280-7 - 2011/12/06 (火) 13:04:12 - もも 寒天培地培養と液体培地培養の文献報告はありますが、報告は少ないです。 文献報告において、培養が非常に難しく、特に菌量が少ないと菌が増殖しなくなり、なかなか試験に使用するのは難しいです。今の文献の培養方法が最も適しているのかどうかも分からないです。そういった経緯があります。 今回私が行う試験では非常に菌量が少ないところで評価しますので、培養法を使うことは難しいです。一度チャレンジはしましたが、菌は増えてきませんでした。 RNA回収についても文献報告はほとんどなく、手探り状態で進めていかなければなりません。まずは既知の菌量からコンスタントにRNAを回収できる抽出法から検討してみます。

(無題) 削除/引用 No.1280-6 - 2011/12/05 (月) 17:15:29 - ~ 培養系はできている菌なのですよね？ 普通にプレートに撒いても1 mL程度は液体サンプルを載せられますし、フィルターろ過したフィルター側をプレート上に置けば、プレート1枚で数L相当の液体サンプルの評価が可能です。 出発材料の状態は分かりませんが、1 cfu/mL未満のサンプルから定量的にRNAを抽出回収し、それから定量RT-PCRでコピー数を調べるということですよね。 その系での報告があるのでしたら出来るのでしょうけれども、手技の影響が大きいでしょうから、添加回収試験のコントロールは十分におかないと心配ですね。

~ さん 削除/引用 No.1280-5 - 2011/12/02 (金) 11:38:19 - もも ご丁寧に回答していただきありがとうございました。 言葉足らずな部分が多く申し訳ありません。 生存しているの定義についてですが、酵母様真菌が増殖はしなくても、生存さえしていれば、評価の対象にしたい思っております。 Real time PCRよりも、プレートに撒いてcfu/mL等で評価した方が、”生存している”状態であると他者に説明しやすいのではないでしょうか？ →まず、評価する菌数が非常に少ないため、プレートに播種して培養法で行う検討はしましたが、生育しませんでしたので、評価はできませんでした。また液体培養にしても同じくできませんでした。そういった経緯からＰＣＲ評価に取り組みました。 RNA→ 確かに、RNAがなければ酵母様真菌が死んでいるとは断定はできないですよね。文献調査で、細菌の定量評価をDNAでは死菌も検出してしまうことから、RNAを用いて、評価している文献がいくつかはありましたが、厳密に言えば、どこまでRNAと死菌が相関するのかは不明です（文献：熱処理、UV処理で細菌を殺し、RNAで評価など）。教えていただきましたこの3点については、よく考えて進めたいと思います。

Harmoniaさん 削除/引用 No.1280-4 - 2011/12/02 (金) 10:28:54 - もも 酵母といっているのは、カンジダやマラセチアといった酵母様真菌のなかでもさらに特定の菌種のことを考えています。

増殖可能な菌の数を示したい？Rear time PCRを使いたい？ 削除/引用 No.1280-3 - 2011/12/02 (金) 09:13:04 - ~ 評価法と目的がマッチしていないように思いますが。 >一般的に無料で使用できるプライマー設計の無料ソフトとかはあるのでしょうか？ Primer 3など、プライマーの設計サイトは公開されています。 http://frodo.wi.mit.edu/primer3/ >生存している酵母の定量評価 最初に、示したい”生存している”の定義を決めてから実験手法を選んだほうがいいと思います。 Real time PCRよりも、プレートに撒いてcfu/mL等で評価した方が、”生存している”状態であると他者に説明しやすいのではないでしょうか？ ●増殖能を持たない細胞由来のRNAの存在： 増殖できない酵母由来のRNAの存在は否定できません。 増殖しない細胞でも、RNAさえあれば生存していると判定するのでしょうか。 ●1細胞辺りのRNA量の変動： 細胞周期や処理等で1細胞辺りの目的のRNA量が変動しないことも予備検討で見ておく必要があるでしょう。 ●死細胞でのRNAの分解速度： その遺伝的にあまり解析されていない酵母は、何らかの処理で殺してから、どのくらいの期間ミトコンドリアRNAが残っているかの情報は無さそうですよね。 などについての確認しておかないと、RNA量が生細胞数に比例するとはいえないでしょう。

(無題) 削除/引用 No.1280-2 - 2011/12/01 (木) 21:01:36 - Harmonia 酵母って、一般名詞の酵母？ それとも、特定の種を思い描いていますか？

primer設計　＋　遺伝子の一般論 削除/引用 No.1280-1 - 2011/12/01 (木) 16:38:45 - もも 一般的に無料で使用できるプライマー設計の無料ソフトとかはあるのでしょうか？ また酵母よりRNAを抽出して、逆転写を行い、housekeeping geneでReal Time PCRを行い、生存している酵母の定量評価を行いたいと思っています。それにあたり、housekeeping geneのどれを用いるのかについてですが、リボソームのITS領域、IGS領域、rRNAの領域の配列しか現状では分かっていません。これらの領域は、酵母が死んでしまってもDNAそのものとしては検出されてしまうのでしょうか。つまり、生存している酵母のみを定量評価するために、DNAでは死んでしまった酵母も検出してしまう可能性があるために、RNAから逆転写を試みようとしています。ミトコンドリアの酵素遺伝子の発現などを見れば、確実に生死を判別はできるのではないかと思いますが、現状この酵母の遺伝子がほとんど不明で分かっていません。 よろしくお願いします。

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