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タンパク質リン酸化の解釈 トピック削除
No.1352-TOPIC - 2011/12/20 (火) 00:44:00 - 院生モリナガ
例えばですが、群A(WTマウス)と群B(KOマウス)に同様の処置を施し、リン酸化ERKの発現量をウエスタンブロッティングで検出したところ、群Bの発現量は群Aと比較して有意に亢進していました。次に、ホールのERKを同様に検出したところ、これも群Bの発現量が群Aと比較して有意に亢進していました。一方、リン酸化ERKとホールのERKの比を比較では、群Aと群Bの間に有意な差は得られませんでした。

このように、pERKの発現量が亢進しているものの、pERK/ERKでは差が見られない場合についての結果の解釈に困っています。リン酸化が亢進しているとしてよいものでしょうか?それとも、ホールの量に違いがあるものはリン酸化の量にも違いがあるのは当然であるのでしょうか?

ご意見の方、お聞かせいただけると幸いです。
 
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(無題) 削除/引用
No.1352-12 - 2011/12/24 (土) 10:34:26 - U
ERK経路の上流因子のTgマウスを何種類か解析した事がありますが、特に同一組織での野生型との比較でERK2の発現に差が見られた経験がありません。個人的にはERK2の蛋白発現は極めて安定している印象を持っています。もしERK2の発現増加が薬剤投与時のみ見られるのであれば、再現性をよく確認した方が良いように思います。 ただし、同一組織内でも、異なる細胞分画(たとえば未分化な幹細胞分画と終末分化した細胞分画)で、ERK1とERK2の比が大きく異なる結果が得られた経験があり、細胞の分化状態に影響を与えるような処置が施されている場合は、ERK1の発現量が変化しているかもしれません。

一方、アクチンについては、NP-40などで可溶化したサンプルを用いた場合にバラツキが見られた経験があり、polymerization (stress fiber formationなど)にかかわる表現形が見られる場合に顕著でした。 個人的には、polymerizeしたアクチンを不溶性のペレットとしてロスした結果と考えており、ERK経路の活性変化に伴い細胞形態が影響を受けるような表現形の場合は、アクチンよりもERK2の方を内部標準として使っています。(あるいはSDSバッファーで直接溶かしたサンプルを用いてアクチンで標準化しています。)

あと、リン酸化されたERKは泳動度が非リン酸化ERKより遅くなるので、リン酸化ERKを多く含むサンプルの場合、トータルERKのバンドが幅広くなります(ゲルの濃さによってはERK1/2それぞれがダブルバンドになります)。 一般にERKの抗体は質がいいため、ブロットがsaturateしてしまう事がよくあり、そのような条件下で幅広になったバンドを定量すると、定量された値が大きく出てしまいます。(分かりにくい表現ですいません。)pERKが高いサンプルでtotal ERKが高くなってしまう原因の一つとして考慮した方がいいかもしれません。

質問の趣旨とはちょっとずれましたが、テクニカルな面で最初の前提に問題がある可能性を感じたので、コメントさせて頂きました。ご参考になれば幸いです。質問そのものに対しては、他の方がおっしゃっているように、リン酸化の亢進とは断言できないけれども、ERK経路のアウトプットとしては増強している可能性が高く、表現形としては後者(pathwway output)の方がより重要と思います。

(無題) 削除/引用
No.1352-11 - 2011/12/23 (金) 18:27:08 - ABZO
定常状態っていうかコントロール群で細胞内全ERKの例えば5%がリン酸化されているとして、ERKの発現量自体が増加して、やはりその5%がリン酸化されれば、ウェスタン上は見かけ上リン酸化は増えたようにみえるけど、この場合、細胞内リン酸化ERKの量は増えたといえるけど、ERKのリン酸化が亢進したとは言わないと思う。全ERKの5%がリン酸化されている状態が、全ERKの10%がリン酸化されている状態になるようなことを、リン酸化亢進というとおもう。ただリン酸化は亢進してなくても細胞内リン酸化ERKの量自体は増えているのだから、その下流への影響はあると思う。

内部標準に使われてる蛋白質も含めてどんな蛋白質でもいえるけど、ERKの発現量は変わらないということはないと思う。

(無題) 削除/引用
No.1352-10 - 2011/12/21 (水) 15:52:00 - 月詠
×  全ERK:リン酸化ERK

○  脱リン酸化ERK:リン酸化ERK

でした。すみません…。;;

(無題) 削除/引用
No.1352-9 - 2011/12/21 (水) 15:46:59 - 月詠
細胞内のシグナル経路のリン酸化実験の成績だけ提示されても、
それだけで整合性のある解釈をするのは難しいと思います。

当該遺伝子Aは疾患Bの原因遺伝子ということなのですが、
処置Cによって病態形成が誘導される疾患モデル系ということなのでしょうか?

・野生型:未処置群 陰性対照群
・野生型:処置C群 陽性対照群=疾患発症モデル
・欠損型:未処置群 対照群
・欠損型:処置C群 実験群(疾患未発症?)

それとも遺伝子A欠損そのもが病態形成を誘導し、
処置Cというのは治療等の介入処置というモデルなのでしょうか?

・野生型:未処置群 陰性対照群=健常
・野生型:処置C群 陰性対照群=
・欠損型:未処置群 陽性対照群=疾患発症モデル
・欠損型:処置C群 実験群  =疾患治療モデル

各群の実験モデル上の位置付けをきちんと把握して実験計画を立てないと
実験成績を解釈する際にそういう恣意が入り込んでくると思いますよ?


基本的に、タンパク質の「脱リン酸化 ⇔ リン酸化」は、
細胞内で平衡状態になっているものと思います。
たとえば、野生型細胞の中で、平時9:1で平衡状態で、
処置Bによってその比率が5:5まで増加して、
シグナルの閾値5を超えて下流の経路が活性化される
というモデルを想定してみます。
このとき、遺伝子Aの欠損で全ERKの発現量が10倍に
増加すると、未処置の平衡状態でも90:10となり、
リン酸化ERKは、閾値5よりも多くなり、
欠損型細胞では、リン酸化ERKの比率自体は野生型と同じでも、
常時閾値を超えるリン酸化ERKが存在するため、
シグナルが常に活性化した状態になると考えられます。

        全ERK:リン酸化
・野生型:未処置群  9: 1 →シグナル陰性(閾値5以下)
・野生型:処置C群  5: 5 →シグナル陽性(活性化)
・欠損型:未処置群 90:10 →シグナル陽性(活性化)
・欠損型:処置C群 50:50 →シグナル陽性(活性化)

この単純な仮説モデルが正しいか否かは、下流の経路(基質)の活性化
あるいは最終的な表現型(病態)などを観察して検証する必要があるでしょう。

(無題) 削除/引用
No.1352-8 - 2011/12/21 (水) 09:27:28 - rrr
「活性化」(シグナルの増強)について言いたいのであれば。ERKの代表的な基質2、3 and/or 想定している(興味が有る)下流のリン酸化を見てみては?
経験を含めて、キナーゼの活性化(亢進)に関わるサイトがリン酸化されていたとしても、必ずしも下流の基質全てのリン酸化が亢進しているとは限らないので。
今回の状況でも基質のリン酸化が亢進しているのであれば、それはそれで「活性化」だと思います。しかし、皆さんと同意見ですが、今回のケースで、リン酸化が亢進していると言うのはどうかと。

(無題) 削除/引用
No.1352-7 - 2011/12/20 (火) 20:19:14 - 院生モリナガ
>オーケー様

貴重なご意見ありがとうございます。先行研究の理解に努めたいと思います。

(無題) 削除/引用
No.1352-6 - 2011/12/20 (火) 20:11:42 - オーケー
よくありそうなケースですね。ERKも例えばの話のような気がしますが、、、。

>私は、発現量が増えることによって、リン酸化量が増えた場合でも、シグナルは増強されているような気がしますが。

私もそう思います。ただこれが面白いかどうかは、ERKの機能と最終的な表現型が一致している場合にある程度限られてきてしまうと思います。うまく一致して説明できれば、オーケーということ。

(無題) 削除/引用
No.1352-5 - 2011/12/20 (火) 20:09:50 - 院生モリナガ
まずは、ご解答ありがとうございます。レスがついて本当に嬉しいです。

>Harmonia様
ホール、リン酸化ERKの値はともにβアクチンで標準化されたものです。リン酸化比は、リン酸化ERK/ホールERKで求めています。

ERKの発現量が状況によって変化する例を今のところ知りません。申し訳ありません。

>う様
確かにおっしゃるとおりです。私も、ホールのタンパク質の発現量が変わることを予想していませんでした。これはマウスに処置を施したもの同士(WT vs KO)の比較で、未処置のもので比較していません。未処置のものを含めた4群で行うことを考えています。

>TS様
貴重なご意見ありがとうございます。これはある病気の原因となる遺伝子のノックアウトマウスなのですが、疾患の発生と関係あるのかもしれません。

(無題) 削除/引用
No.1352-4 - 2011/12/20 (火) 14:58:12 - TS
ERKの発現量が上昇しても特におかしくはないと思います。
そういう表現型ももちろんあるでしょう。

表現型としては、リン酸化が高くなっているのではなく、
総発現量が上がっていて、それに伴って、リン酸化も同様に上がっている、などの言い方が良いような気がします。

このERK上昇がKOマウスの表現型(ERKのことではなくて)に関係しているかどうか、はどうなるのでしょうか。
私は、発現量が増えることによって、リン酸化量が増えた場合でも、シグナルは増強されているような気がしますが。

(無題) 削除/引用
No.1352-3 - 2011/12/20 (火) 14:42:00 - う
リン酸化してるとかを考える前に、

「ERKの発現量が違う」

ということが表現形だと思いますが。

単刀直入に言うと、

ERKの発現量が違うのに、そのリン酸化の量なんて言っても意味が無い
何を見ているのが、何が言いたいのかわからない

と思います。


個人的には、ERKの発現量が違うというよりも、
手技的に、サンプリングに問題がある、タンパク量とか組織とか細胞とか
調整に間違いがあるような気がしてなりません。
ERKの量が違うことを体験したことが無いので。

(無題) 削除/引用
No.1352-2 - 2011/12/20 (火) 08:24:45 - Harmonia
ちょっと前の
http://www.kenkyuu2.net/cgi-biotech2011/biotechforum.cgi?mode=view;Code=1319
のスレと似ていますが、
「基準値はナニですか?」
> ホールのERKを同様に検出したところ、これも群Bの発現量が群Aと比較して有意に亢進していました。
のときの基準値です。

要点は
「ホールのERKの量は群Aと群Bを比較して、群Bで多い」というのは、どのくらい確からしいですか?
ということです。

ある単位量あたり何グラムとか何分子という言い方をしてください。あるいは、できるだけそれに近い表現を用いてください。

 * * * * * * * * * * * * * * 
門外漢なので、質問。
ERKのタンパク発現量が、状況によって変化するということは、一般的な現象なのでしょうか?

タンパク質リン酸化の解釈 削除/引用
No.1352-1 - 2011/12/20 (火) 00:44:00 - 院生モリナガ
例えばですが、群A(WTマウス)と群B(KOマウス)に同様の処置を施し、リン酸化ERKの発現量をウエスタンブロッティングで検出したところ、群Bの発現量は群Aと比較して有意に亢進していました。次に、ホールのERKを同様に検出したところ、これも群Bの発現量が群Aと比較して有意に亢進していました。一方、リン酸化ERKとホールのERKの比を比較では、群Aと群Bの間に有意な差は得られませんでした。

このように、pERKの発現量が亢進しているものの、pERK/ERKでは差が見られない場合についての結果の解釈に困っています。リン酸化が亢進しているとしてよいものでしょうか?それとも、ホールの量に違いがあるものはリン酸化の量にも違いがあるのは当然であるのでしょうか?

ご意見の方、お聞かせいただけると幸いです。

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