BioTechnicalフォーラム [SDS-PAGEのときウェルにサンプルが張り付くように残ってしまう]

(無題)

No.1353-18 - 2011/12/23 (金) 00:16:27 - ab

> >温度を上げれば分解反応が進む確率があがると思うのですがどうでしょうか。
> 相当、強い加熱がないと粘性が下がるくらいの断片化は起こらないと思います。
粘性がでるのは、かなり長いgenomic DNAが残っている場合で、数kから数十k程度まで断片化されていれば、十分粘性は下がりますよね。
いくつか例を提示していただいてますが、粘性を下げるのに数百まで下げる必要ははないでしょう。

> なので、還元剤で容易にできるなら応用もできるんじゃないかと思ったんです。
還元剤がなくても粘性が下がっているので、界面活性剤が寄与しているかもしれませんね。

(無題)

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No.1353-17 - 2011/12/22 (木) 09:16:26 - AP

>温度を上げれば分解反応が進む確率があがると思うのですがどうでしょうか。

相当、強い加熱がないと粘性が下がるくらいの断片化は起こらないと思います。

ケース１）
ISHなどのために一本鎖RNAプローブならアルカリ水解でプローブを断片化（100～数百ntに）しますが、一本鎖DNAを使う場合は、30分間のボイルをするというプロトコールがあります（Rocheのハンドブック参照）。しかし、実際やってみると、あんまり断片化しないので、私はボイルの前にHClでdepurinationするという方法をとります。

ケース２）
キャリアDNAとしてsalmon sperm DNA水溶液を調製するとき、これも数百nt程度に断片化する必要があります。ソニケーションと使うのが一般的でしょうが、滅菌する条件でオートクレーブをかければちょうどよく断片化出来ます。ボイルではそうはいきません。

なので、還元剤で容易にできるなら応用もできるんじゃないかと思ったんです。

(無題)

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No.1353-15 - 2011/12/22 (木) 07:31:03 - ab

DNAの分解は加水分解なので、理論上は酵素がなくても条件がそろえば反応は進むのでは。
温度を上げれば分解反応が進む確率があがると思うのですがどうでしょうか。
ゲノムDNAは大きいので、数kbくらいの断片までは加熱で加水分解されてもおかしくない気もします。
それとも、サンプル回収したときにニックが入って、加熱する事で一本鎖になることで、小さい断片になるとか。

いずれにしても、いくら粘度が低くても、サンプル中に大量のDNAが残っていれば泳動に影響しそうですね。

> もしDNAがノーダメージということであれば、PCRでのジェノタイピング用にゲノム抽出する程度なら、proK無しで加熱してフェノクロで大丈夫な気がしますがいかがでしょう。もしできるのであれば、このほうが安くて早くて良いですね。
話がそれてしまいますが、マウスのジェノタイピングくらいならHotShotが簡単です。ear punchでも十分です。
この場合、アルカリ性の溶液中で加熱するので、結構ゲノムDNAはズタズタになります。
Biotechniques. 2000 Jul;29(1):52,54

DNAについて

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No.1353-14 - 2011/12/21 (水) 19:11:03 - お粗末君

DNAが完全に分解という意味ではなくて、clumpが分解するという意味で書いたのですが誤解を与えてしまいました。申し訳ありません。
非還元で加熱するとSS結合切れてしまうものもあるので非還元で加熱したことはないのですが、それでも粘性は無くなるのですね。知りませんでした。
では、おそらく、DNAがdenatureというよりクロマチンがSDSによってdenatureされることが重要なんですね。DNAのdenatureなら冷やせば戻ってしまいます。
もしDNAがノーダメージということであれば、PCRでのジェノタイピング用にゲノム抽出する程度なら、proK無しで加熱してフェノクロで大丈夫な気がしますがいかがでしょう。もしできるのであれば、このほうが安くて早くて良いですね。

(無題)

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No.1353-12 - 2011/12/21 (水) 09:49:57 - K&K

①-③を試してみました。

実は全てにおいて状況は改善されたのですが、①③は特に効果的だった印象です。（単なる）オーバーロードだったということでお騒がせいたしました。

還元剤によるDNA分解、どうなんでしょうか。私は時々2%SDSを含むライシスバッファー(2MEなし)でtotal cell/tissue lysateを作りますが、直後はどろどろです。でも15分加熱すればさらさらになってくれるので、少なくとも還元剤(2ME)が効いている印象は少ないのですが・・・。

いずれにせよ、皆様ありがとうございました。

(無題)

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No.1353-11 - 2011/12/21 (水) 09:36:39 - rrr

> DNAは還元剤存在下で過熱すれば分解されますよ。

私もAPさん同様の質問というか、？です。
どんなにサンプルを加熱しようがゲノムでドロドロなものはドロドロです。ボイルしていたのをすっかり忘れて30分した場合でも。
2xにすればOK、ってことですか？
基本的に扱っているサンプルのタンパク質濃度は<1mg/mlなのでそれもピンと来ません。

(無題)

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No.1353-10 - 2011/12/20 (火) 13:29:02 - K&K

皆様ありがとうございます。

まず、マーカーはきちんと流れており、ゲルは大丈夫なのではないかと考えています。

6xSBとRIPAの組み合わせは他の実験でも使っており、これまで同様の問題は起きませんでした。

確かに、厳密にはNP40の最終濃度は同じではありませんが、濃度調整前でもそれほど濃度は違わないので、NP40の最終濃度もサンプル間で2倍は違わないのですが・・・。

トラブルシューティングとして、

①蛋白濃度を下げたものを流してみる
②SBを多めに加えてみる
③サンプル組成はそのままでアプライ量を減らす

あたりを試してみようと思います。

(無題)

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No.1353-9 - 2011/12/20 (火) 13:12:11 - AP

6x sample buffみたいな濃いのを使ったことがないので、みなさんにお聞きしたいのですが、

6x sample buffだと、サンプルからのバッファーの持ち込み量が多いのが問題を起こすのかもしれない、とも考えたのですが（pHがRIPAに引っ張られるとか、デオキシコール酸が不溶化するとか）、そういう事ってありえますか？

>希釈には界面活性剤なしのTNE bufferを使っているので、NP40の最終濃度は0.2-0.3%くらいだと思います。

サンプルによって希釈率が違う=>最終的なバッファー組成が違うことになりますが、それとは無関係に起こりますか？

>DNAは還元剤存在下で過熱すれば分解されますよ。

これは初耳でもしそうならいろいろ応用が効くんですけれど、還元剤存在下で特別に起こることなのでしょうか。その反応機序は？

(無題)

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No.1353-8 - 2011/12/20 (火) 12:45:08 - う

簡単に。

１、問題があったサンプルを適当に希釈したものを用意して
泳動してみる

２、マーカーはきちんと流れているか確認する。

あれこれ考える前に、やってみたのでしょうか？

１で泳動するサンプルの濃度が適当か夾雑物の存在の可能性がわかるし、
２でゲル自体が大丈夫かわかります。

すぐに原因が絞れます。
見た目に粘性が無いからといって、そこに泳動を阻害するものが
無いということではないでしょう？

(無題)

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No.1353-7 - 2011/12/20 (火) 12:42:23 - K&K

コメント大変ありがとうございます。

ホモジェナイズ後のサンプルは1.5mlチューブでx20000rcfで15分間遠心しています。最上層のfat layerとペレットのコンタミを避けるために、チューブ脇から針付きシリンジを刺して中間層（澄んでいます）のみを吸っています。・・・なので、不溶画分は除けていると思うのですが・・・。

ホモジェナイズ後のタンパク濃度は10mg/ml前後ですが、最終的に2-3mg/mlになるようにサンプル間の濃度を合わせています。希釈には界面活性剤なしのTNE bufferを使っているので、NP40の最終濃度は0.2-0.3%くらいだと思います。6xサンプルバッファーを3xのつもりで使うということですね。

同僚はオーバーロードを指摘していました。この際サンプルバッファーを多めに使ったものとタンパク濃度を下げたものを両方試してみます・・・。

他にもご指摘ありましたらよろしくお願いします。

over load

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No.1353-6 - 2011/12/20 (火) 11:50:54 - お粗末君

サンプル濃度を下げたくないことを前提として書いております。
RIPA bufferはSDSを和らげるためにNP-40を10倍濃度で加えてあります。
高濃度の非イオン性界面活性剤はSDS-PAGEを乱します。
タンパク質濃度が極めて高い場合、NP-40も含めたSDS化ができてはいないのではないでしょうか。
泳動バッファーにもSDSが入っていますが、サンプルの濃度に比べたら10倍以上低いはずです。
泳動開始の時点でしっかりとSDS化することが目的です。
このような経験はないので憶測です。
SDS sample bufferを二倍濃度にしても問題はありません。

(無題)

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No.1353-5 - 2011/12/20 (火) 10:58:49 - すみきった状態

まず、アプライするサンプルは、完全にすみきっていて濁っていないでしょうか？
濁っていたら、常温の最高回転数の遠心で完全にすみきった状態にします。（目的に支障がなければですが。）　カリウムが多いと濁りますが、必ずしも問題にはなりません。

もし、すみきった状態なら、オーバーロードの可能性が高いので、何かのついでに3倍希釈（など）したサンプルを乗せれば判断がつきます。

(無題)

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No.1353-4 - 2011/12/20 (火) 09:59:24 - K&K

早速のコメントありがとうございます。

gDNAについては意識しており、サンプルバッファーを入れて加熱後に糸を引かないことをチェックしております。また、アプライにはゲルローディングチップを使っていますが、細いチップ先からの吸引・排出はスムーズにいっております。

お粗末君さまご指摘の、final 2xSDS SBになるようにするというのはどういうメリットがあるのでしょうか？　変性還元をもっとしっかりさせるためでしょうか？

いらんもの

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No.1353-3 - 2011/12/20 (火) 09:30:03 - お粗末君

DNAは還元剤存在下で過熱すれば分解されますよ。
煮沸後のサンプルの粘性でわかります。加熱時間を延長すると良いかもしれません。
DNAでなければRIPAのNP-40などが影響しているのかもしれません。
大丈夫なレーンがあることを考えると、final 2xSDS sample bufferになるようにすると改善するかもしれません。

(無題)

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No.1353-2 - 2011/12/20 (火) 07:40:33 - AP

過去トピに何度かでていますが、ゲノムDNAの混入のせいだと思います。
DNAが、ホモジナイズの過程で十分剪断されていなかったり、アプライのときにピペットに吸い込まれた量が多かったサンプルが問題を起こしていのでしょう。
シリンジを使って注射針の中を往復させるとか、ソニケーションするとかして、ライセートに含まれるDNAを剪断してみては。

SDS-PAGEのときウェルにサンプルが張り付くように残ってしまう

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No.1353-1 - 2011/12/20 (火) 02:18:58 - K&K

よろしくお願いします。

SDS-PAGEの際、ウェルにアプライしたサンプルが泳動開始後30分くらい残ってしまいます。BPBがウェルの底面と側面に部分的に残り、30分くらいかけて徐々にはがれるように流れ出し、最終的には泳動の先頭に合流します。

WBしてもサンプルの流れが悪かったレーンはバンドがfuzzyです。鉛筆で書いた線を消しゴムで中途半端に消したような感じです。同一ゲル内でもきちんと流れるレーンと流れないレーンがあり、その差ははっきりしています。

同じSDSサンプルバッファーを使ってもそうなるときとならない時があり、ウェルが細かいゲルの時に多い気がします。

もちろんサンプルは遠心して、fat layerとペレットは除いています。流れるレーンと流れないレーンがはっきりしており、どうもタンパク調整に原因がある印象なのですが、原因と対策について、お知恵を拝借できましたらありがたいです。

ライセート：マウス肝臓 in RIPA + 6xSDSサンプルバッファー + 煮沸5分
アプライ：濃度2-3mg/mlのものを20uL/well
ゲル：プレキャストミニゲル(Tris-Glycine, 12well)
120V等電圧

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