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遺伝子特異的プライマーによるcDNAの生成 トピック削除
No.1369-TOPIC - 2011/12/22 (木) 12:11:33 - Miffy
現在パラフィンブロックからRNAをエクストラクトしcDNAの作成を行っています(RNeasy FFPE kit from QIAGENを使用)。最終目的はターゲットの遺伝子の組織での発現を調べるためです。

RNAのクオリティはナノドロップで測定した範囲では260/230, 260/280ともに2に近くエクストラクトの過程は問題がないと思っています。

しかしリアルタイムをかけてみたところb-actinもうまくかかりません。リアルタイムの系は細胞などを使った場合は問題がありません。結論としてRNAの断片化が問題で増幅できないのではないかと考えています。

そして以下改善することにしました。
1、cDNAの作成に用いている酵素を変えてみる。
現在はInvitrogenのtranscriptase IIIを使っていますがQuantiTect Reverse Transcription Kit from QIAGENにしてみようと思っています。
2、リアルタイムPCRの産物は現在200bpなのですが100bp位に減らすようにプライマーのデザインをしなおす。
3、遺伝子特異的プライマーによるcDNAの生成

1と2は問題なくできるのですが3についてどのようにプライマーをデザインしたら良いのか教えていただきたく思っています。

US在住ですのでもし書籍ではなくウエブサイトで参考になるものがあれば教えていただけると幸いです。

またフリーでダウンロードできるcDNAの生成に使用可能な遺伝子特異的プライマーデザインソフトなどご存知でしたら是非教えていただきたいです。

どうぞよろしくお願いいたします。
 
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(無題) 削除/引用
No.1369-3 - 2011/12/28 (水) 17:19:17 - ta
primer3とか使えますよ。

beta actinもかからないのは脂肪さんと同じ意見ですが。電気泳動で、18sと28sのシャープなバンドが見られますか?

(無題) 削除/引用
No.1369-2 - 2011/12/22 (木) 15:53:05 - 脂肪
>b-actinもうまくかかりません。

それってRNAが分解してないですか?
ODじゃ分解具合は判定できないですよ。

遺伝子特異的プライマーによるcDNAの生成 削除/引用
No.1369-1 - 2011/12/22 (木) 12:11:33 - Miffy
現在パラフィンブロックからRNAをエクストラクトしcDNAの作成を行っています(RNeasy FFPE kit from QIAGENを使用)。最終目的はターゲットの遺伝子の組織での発現を調べるためです。

RNAのクオリティはナノドロップで測定した範囲では260/230, 260/280ともに2に近くエクストラクトの過程は問題がないと思っています。

しかしリアルタイムをかけてみたところb-actinもうまくかかりません。リアルタイムの系は細胞などを使った場合は問題がありません。結論としてRNAの断片化が問題で増幅できないのではないかと考えています。

そして以下改善することにしました。
1、cDNAの作成に用いている酵素を変えてみる。
現在はInvitrogenのtranscriptase IIIを使っていますがQuantiTect Reverse Transcription Kit from QIAGENにしてみようと思っています。
2、リアルタイムPCRの産物は現在200bpなのですが100bp位に減らすようにプライマーのデザインをしなおす。
3、遺伝子特異的プライマーによるcDNAの生成

1と2は問題なくできるのですが3についてどのようにプライマーをデザインしたら良いのか教えていただきたく思っています。

US在住ですのでもし書籍ではなくウエブサイトで参考になるものがあれば教えていただけると幸いです。

またフリーでダウンロードできるcDNAの生成に使用可能な遺伝子特異的プライマーデザインソフトなどご存知でしたら是非教えていただきたいです。

どうぞよろしくお願いいたします。

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