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(無題) 削除/引用 No.1375-13 - 2011/12/27 (火) 15:07:59 - 生物初心者 み様 反応時間が2時間でもバックが高くなっているので、反応時間を延ばすことをためらっていました。4度O/Nでも確認してみます！！

(無題) 削除/引用 No.1375-12 - 2011/12/27 (火) 09:17:30 - 通りがかり まぁ、質問した人はここで免疫染色で一連の質問をした人と同じ人だと思うけど、 変に「実験してます、頭使っています」と酔うよりも 屁理屈を並べるよりも、基本を抑えて（基本的な書籍は沢山ある） きちんとコントロールおいた実験をしてこうよ とアドバイスしたいですな。 いるんですよね、初心者でまず屁理屈をこねたがる人・・・。

(無題) 削除/引用 No.1375-11 - 2011/12/26 (月) 21:37:53 - み >[Re:8] 生物初心者さんは書きました : > 確かに、4時間ほど行なっている報告も多いようです。 > ただ、教えていただいたプロトコルよりも小さな切片を扱っているので、 > 時間は十分なのかと考えています。 小さなって何？面積？関係ないと思う。 厚さなら関係あるけど。 時間は十分かどうかは条件を振らないと判断できないです。 4度Ｏ／Ｎでやってみてシグナルが強くならないのなら時間は十分だったと思うけど。 室温数時間で反応性弱くて、4度O/Nで強くなった経験幾らでもある。 4度Ｏ／Ｎでやってみてシグナルが強くならなくて、ノイズも低ければ抗体濃度上げるべきかなあ。 > > 濃度は10μg/mlを1：100〜200で行なっていますので、濃い方ではないかと。 > そんなことないよ。薄いと思うけどね。

(無題) 削除/引用 No.1375-10 - 2011/12/26 (月) 15:27:59 - 生物初心者 ＞室温って言うけど、そんなに重要なことかな？ 20度で２時間、4度でO/Nというプロトコルがある場合、10度台ではどうなのか。というと20度と反応時間に大分差が出るのでは。と考えた次第です。 ＞細かいことをケチってうまく行かないなんて愚の骨頂ではないか おっしゃるとおりです。 ただ短時間でできるのであれば、それに越したことはないので質問させて頂きました。

(無題) 削除/引用 No.1375-9 - 2011/12/26 (月) 13:27:01 - Q 場を乱すようですけど。。。 室温って言うけど、そんなに重要なことかな？ 18℃ではシグナル薄くて 25℃ではシグナル強いって 劇的に変わった人っていますかねぇ・・・。 作業を短縮したいっておっしゃいますが、 うまく行くことが一番の近道であって、 細かいことをケチってうまく行かないなんて愚の骨頂ではないかと思います。

(無題) 削除/引用 No.1375-8 - 2011/12/26 (月) 12:16:40 - 生物初心者 皆さんご返答ありがとうございます！！ インキュベーターを利用されていた方々もいらっしゃるようで、試してみようと思います。 ＞二時間は比較的短時間の部類にはいると思います。 確かに、4時間ほど行なっている報告も多いようです。 ただ、教えていただいたプロトコルよりも小さな切片を扱っているので、 時間は十分なのかと考えています。 濃度は10μg/mlを1：100〜200で行なっていますので、濃い方ではないかと。 インキュベーターの利用を行なってみます！！

(無題) 削除/引用 No.1375-7 - 2011/12/26 (月) 08:11:44 - 組織 反応時間を短くするなら、37度1時間（あるいは30分）でしょうね。私はやったことありませんが、この条件をルーチンでやってるラボがあるので、試してみる価値はあると思います。二次抗体とか検出系など、始めに条件検討が必要ですが。

(無題) 削除/引用 No.1375-6 - 2011/12/25 (日) 09:51:03 - 774 抗体反応とはちがうのですが、 HRPやAPをつかった発色反応も室温でやることが多いのですが、 冬場だと一晩おいても全然進まなかったりしますね。 インキュベーター20℃で一晩おいたりしています。

(無題) 削除/引用 No.1375-5 - 2011/12/25 (日) 08:47:54 - カイ 昔、日本で大学院生をしていたころ、夏は染色がうまくいっていたのに冬になってうまくいかなくなった…そうか！室温っていっても温度違うじゃん！ と思ったことがありました。 皆さん仰ってますが、室温は20-25℃でいいと思います。 25℃のインキュベーターにつっこんで問題解決したことがありました。 ただ、ドライになってしまうといけないので、湿潤にしたチャンバーを使うといいです。 （簡便にはペトリディッシュやプラスチックの箱に濡らしたキムワイプをしいて、その中で染色するとかでもいいです。） 夏冬温度が一定に完備されてるラボだとそういう心配はないのですが。 でも私はいつからか染色も一次抗体は4℃オーバーナイトでやるようになったので、室温とか関係なくなったなぁ…

(無題) 削除/引用 No.1375-4 - 2011/12/24 (土) 19:06:30 - KEN 染まりが薄いということですが、二時間は比較的短時間の部類にはいると思います。 抗体の希釈が濃ければ問題有りませんが、少しのばしても良いかと思います。 また、反応温度を室温or37℃くらいでやるという方法もあります。 私のラボでは、特に冬場だと室温放置だと10℃以下に下がってしまうので、恒温器に容器ごとつっこんでいたりします。 また、他の方が言われるように、4℃overnightを試されてみても良いと思います。 反応時間が短いというのが今回の一番の要因だとは思いますが、賦活液のpHを高くすると比較的濃く染まりやすくなったりします。(組織の挫滅も増えますが。。。)

(無題) 削除/引用 No.1375-3 - 2011/12/24 (土) 19:04:43 - 生物初心者 通りすがりんさん ご返答ありがとうございます。 やはり室温を２０度に保つのとインキュベーターに入れるのとでは反応は異なるのでしょうか。 O/Nだと一次抗体と二次抗体とで２日要すため、反応時間を短くしたいと考えているのですが。。。 もちろん温度は一要因と考え、他の検討も同時に行なっています！！

(無題) 削除/引用 No.1375-2 - 2011/12/24 (土) 17:43:49 - 通りすがりん 室温は20−25℃で問題ないです。 インキュベーターに入れるプロトコールは一般的ではないと思いますので、それを行うくらいでしたら４℃オーバーナイト（12-16h）が良いかもしれません。 そもそもシグナルが弱い原因は、いくつか考えられます。 抗体がワークしていないのかもしれませんし、もしかしたらターゲットのタンパクの発現が低いためかもしれません。

免疫染色で言う室温とは？ 削除/引用 No.1375-1 - 2011/12/24 (土) 16:38:24 - 生物初心者 こんにちは、いつもお世話になっております。 免疫染色を始めたばかりの初心者です。 抗体反応を室温2時間で行っていますが、反応が薄く原因を究明中です。 そこで、室温とは何度だと疑問に思いました。 反応中は恒温器にいれようと考えていますが、何度にするか迷っています。 20−25℃あたりかと考えていますが、 最適温度はあるのでしょうか。 よろしくお願いいたします。

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