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(無題) 削除/引用 No.140-12 - 2011/03/15 (火) 22:53:44 - Actias プロメガはT3 polのT7からの読みがあるのがいやなので、SP3を使っているといううわさを聞いたことがある。

(無題) 削除/引用 No.140-11 - 2011/03/11 (金) 17:17:22 - AP 同じロットのsense probeが、当初染まらなかったのに、のちのち染まるようになったということですよね。 疑問点）sense probeで染まるパターンは　anti-senseと同一と見なされるのか、別のもか？ 同一なのであれば、説明が難しい（ほかの皆さんの指摘をもってしても）んじゃないでしょうか。 むりやりこじつけると、 ・anti-senseプローブで見えていたのは実は非特異的染色で、sense probeは時間がたって分解などが進んで特異性が下がってから初めて染まりだした。 ・実はsense-probeには副産物としてanti-senseを含んでいた。初めのうちは変性不足で副産物のanti-senseは働いていなかったが、のちに十分に変性されるようになって染まりだした。 ほかに可能性ありますか？ ちなみに、IVTで副産物として反対鎖のプローブができる可能性があることは、過去トピで論じました。

(無題) 削除/引用 No.140-10 - 2011/03/11 (金) 16:45:29 - Boston-Pullman on ice で充分だと思います。 私の場合は、プロ-ブのみを熱変性させた後、急冷処理したものを小分注してフリーザー保存しています。使用分だけ溶かしてハイブリバッファーに添加します。その後の熱処理は行いません。

(無題) 削除/引用 No.140-9 - 2011/03/11 (金) 16:09:56 - embryo ありがとうございます。 ＞ちなみに、熱変性後は氷水で急冷されていますか？ on iceにしてみたこともあったのですが 基本的には行っていません。 急冷が必要でしょうか？

(無題) 削除/引用 No.140-8 - 2011/03/11 (金) 13:14:21 - Boston-Pullman 200マイクロだともうちょっと長めの方がいいかもしれません。 ちなみに、熱変性後は氷水で急冷されていますか？

(無題) 削除/引用 No.140-7 - 2011/03/11 (金) 12:46:58 - embryo 再び回答ありがとうございます。 ＞温度は良いと思うのですが、容積によって温度があがるまでに時間がかかります。なので、５分間というのが十分であるのかが微妙ですね。 容積は、1.5mlチューブでプローブの調整をしており、 1チューブあたりのハイブリ液の全量は200μlです。 一度検討してみます！

(無題) 削除/引用 No.140-6 - 2011/03/11 (金) 05:48:12 - Boston-Pullman 温度は良いと思うのですが、容積によって温度があがるまでに時間がかかります。なので、５分間というのが十分であるのかが微妙ですね。

(無題) 削除/引用 No.140-5 - 2011/03/10 (木) 17:32:56 - embryo Boston-Pullmanさん、コメントありがとうございます。 ＞Heat denatute をやり直して見るのも手です。 すみません、質問文にはは記述しなかったのですが 毎回、ハイブリ前にプローブとhybri solution、硫酸デキストランとの 混和後、80度で5分間denatureを行っています。 温度と時間を検討しなおしてみようと思います。

(無題) 削除/引用 No.140-4 - 2011/03/10 (木) 15:27:17 - embryo コメントありがとうございます。 ＞センスプローブのロットは同じでしょうか？ -20度で凍結保存したプローブを、毎回融解し使用しています。 なので、PCRによるコンタミと言うよりは プローブそのものの性状の変化ではないかと思ったのですが。。。 ＞同じ時に作製して保存しておいたものだとしたら、分解してしまって特異性が落ちたということは考えられると思います。 こちらのほうが可能性が高いかもしれません。 再合成を検討したいと思います。

(無題) 削除/引用 No.140-3 - 2011/03/10 (木) 15:17:40 - Boston-Pullman Heat denatute をやり直して見るのも手です。

(無題) 削除/引用 No.140-2 - 2011/03/10 (木) 13:24:04 - in situ センスプローブのロットは同じでしょうか？ もし、違う時に作製したものであれば、PCR関連のコンタミも疑われます。 同じ時に作製して保存しておいたものだとしたら、分解してしまって特異性が落ちたということは考えられると思います。 再合成して実験してみてはいかがでしょう。

in situ hybridizationのセンスプローブ 削除/引用 No.140-1 - 2011/03/09 (水) 22:31:29 - embryo 500bp程度の5種類のプローブを用いてISHを行っています。 はじめは手技的なことや条件設定などに手こずりましたが、 センスプローブには何の問題もありませんでした。 ところが最近、3つのセンスプローブにおいて、 シグナルが検出されるようになってしまいました。 以前は全く染まっていなかったため、配列に問題があるとは 考えにくいです。 また、アンチセンスプローブよりもシグナルが強いため、 コンタミの可能性も低いと思われます。 さらに、何度繰り返してもシグナルが見られることから、 のせ間違えなど、初歩的なミスでもないと思うのですが、 そうなるとこうなった原因に見当がつきません。 プローブの扱いや保存方法によって、性状が変化する可能性が あるのでしょうか？ 原因と対処法をお教えいただければ幸いです。 ちなみに検出はDIGラベルプローブ、 anti-DIG-AP、BCIP-NBTによって行っています。

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