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(無題) 削除/引用 No.155-4 - 2011/03/17 (木) 10:51:57 - ワラビー ンンノ様，Boston-Pullman様，ご回答ありがとう御座いました。 原理的には間違っていなくても，やはり気持ち悪いですよね とりあえず，新しいプライマーを使って方法を統一することにしました。 データのばらつきについては今後同じ資料でのqPCRを再度行い，検討を行っていく予定です。

(無題) 削除/引用 No.155-3 - 2011/03/16 (水) 06:46:15 - Boston-Pullman ンンノさんの気持ち悪いに同感です。ということは、レビュアーも感じることと思います。 実験系はとにかくシンプルにするよう心がけたほうが良いかと思います。

(無題) 削除/引用 No.155-2 - 2011/03/16 (水) 00:03:19 - ンンノ 原理的には検出法が違っても問題ないはずですが、気持ち悪いですね。 結果がばらつくのは他の要因のように思えます。 >この際，増幅・検出後のThreshold Lineはautoで定め，Ct値を導き出しています。 この方法はいつも再現のよい数値を返してますか。 蛍光強度に依存するようなアルゴリズムだと、反応液量や蛍光色素のへたり、 プレート上のウェルの場所によって数値が違ってくるような気がします。

Real time PCR検出方法の併用について 削除/引用 No.155-1 - 2011/03/15 (火) 17:39:22 - ワラビー 初めまして。 まだまだ不勉強ですが宜しくお願い申し上げます。 同じプレート上で，インターカレーション法を用いて測定したコントロールとハイブリダイゼーション法を用いて測定した目的遺伝子の両者を使って，ΔΔCt解析を行うのは正しいでしょうか？間違っているのであれば出来ればその理由を教えてください。 現在GAPDHを内在性コントロールとしてMyogeninの発現解析をReal time PCRで行っています。 予算の面もあり，96wellの１枚のプレート上で GAPDHに対しては，それまでにアガロースゲルでの電気泳動を行っていた時に使っていたプライマーにSYBRgreenを使って検出しています。 Myogeninに対してはTaqManのGene Expressin Assays を使用して検出を行いました。 この際，増幅・検出後のThreshold Lineはautoで定め，Ct値を導き出しています。 1回目のPCRと同じ検体を用いて行った2回目のPCRではΔΔCt解析の結果に大きな開きが出てしまいました（１０倍以上）。根本的に2つの遺伝子のリアルタイムPCRの検出方法は統一しなければならないということでしょうか？ 一応リアルタイムPCR後の増幅産物をアガロースゲルにて電気泳動を行った際には予想通りの位置にそれぞれ単一のバンドを認めております。 皆様宜しくお願い申し上げます。

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