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(無題) 削除/引用 No.166-16 - 2011/03/22 (火) 18:34:26 - くまぷぅ DOXの除去による、Tet-offシステムでの遺伝子誘導は結構難儀です。 DOXは細胞内や、細胞外マトリックスにも蓄積しているようで、付着細胞では最低限、トリプシナイズ＆継代し、翌日にPBSで数回の洗浄、その後、専用FBSを用いて培養することが必要です。 とにかく、DOX除去のために、ひたすら洗い続けることが必要と思われますので、一度培養条件を検討してみてはいかがでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.166-15 - 2011/03/20 (日) 04:26:37 - Boston-Pullman >[Re:13] 初心者さんは書きました : > pTRE hygのベクターは、Tet専用の細胞でないと発現確認できないのでしょうか。 rTA plasmid と共発現するのであれば、普通の細胞でも問題ないです。卒研生とのことなので、Invitrogenのウェブサイトで勉強することを薦めます。 > Tetの系ではない普通の方法でHela細胞にTransfectionしている実験をラボの方がされているのですが、私がチェックした抗体と同様の抗体を使用されており、タンパクも安定していると考えられます。 ならば、そのplasmidをつかってtransfectionの条件検討をするべきです。Lipofectamine で死んでしまうとのことでしたが、条件（細胞数、プレートの大きさ、培地の量、血清の有無、プラスミドの量、試薬の量、試薬と細胞の反応時間）を教えてください。どんな試薬であろうが、これらは検討すべき最低限のファクターです。

(無題) 削除/引用 No.166-14 - 2011/03/19 (土) 16:40:45 - 初心者 atsさん 遅くなりまして申し訳ないです。 コメントありがとうございます。 48時間では一度実験してみたのですが、それでも見たいバンドが見れなくて72時間にしていました。検討してみます。

(無題) 削除/引用 No.166-13 - 2011/03/19 (土) 16:37:58 - 初心者 masaさん 遅くなり申し訳ありません。 コメントありがとうございます。 1.プラスミド自体と構築したコンストラクト 配列を確認しているプラスミドから切り出して、その後何度かプラスミド精製をして得たプラスミドを使用しているので、一度も配列を確認していませんでした。 配列確認を行ってみます。 2.遺伝子の導入効率 pTRE hygのベクターは、Tet専用の細胞でないと発現確認できないのでしょうか。 3.目的の遺伝子の性質と抗体、タンパクの安定性 Tetの系ではない普通の方法でHela細胞にTransfectionしている実験をラボの方がされているのですが、私がチェックした抗体と同様の抗体を使用されており、タンパクも安定していると考えられます。

(無題) 削除/引用 No.166-12 - 2011/03/19 (土) 14:58:00 - 初心者 -Boston-Pullmanさん 遅くなって申し訳ありません。コメントありがとうございます。 Lipofectamine 2000は細胞が死んでしまうことが多かったので今回は使用していませんでした。 Tet-Onシステムの方が、Tet-Offシステムより普及していたりするのですか？ 友人の研究室もTet-Onシステムを使用しているケースが多かったので気になります。

(無題) 削除/引用 No.166-11 - 2011/03/19 (土) 14:55:26 - 初心者 >- tet以前に 遅くなり申し訳ありません。コメントありがとうございます。 Tetの細胞は、大分以前に購入されたものらしく、CHO-AA8のコントロール細胞があるかどうかは不明です。 pTREのベクターは例えば293T細胞でも発現するものなのでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.166-10 - 2011/03/18 (金) 17:09:53 - ats 皆さんの意見に追加で...。 目的遺伝子の過剰発現が細胞毒性を引き起こす場合があります。この場合、72時間だと発現細胞が浮いてしまい、回収されていない可能性もあります。 発現誘導後数時間で遺伝発現が始まりますので、10-24時間あたりで調べてみることも検討してください。

(無題) 削除/引用 No.166-8 - 2011/03/18 (金) 15:10:49 - masa 他の方のアドバイスと被ってしまいますが、それぞれの不安を解決するコントロールをしっかりと用意する必要があります。 1、プラスミド自体と構築したコンストラクトを疑う。 コンストラクトに用いたプラスミドは同じ容器から取って他のコンストラクトで成功した実績はありますでしょうか？大腸菌で増幅する際に変異が入っている可能性は否定できません。（購入後一度も増幅していなければ大丈夫でしょう） また目的の配列が挿入されたプラスミドの配列はどの部分まで確認していますか？目的の配列は大丈夫でもプロモーター部分の配列に変異が入っていてたら発現しないこともあります。プラスミドの全長をシークエンスするのは大変なので、ミニプレップで取得したいくつかのクローンで発現チェックをすることも大事です。ミニプレップに慣れないうちはDNAが変性してしまって取れているはずなのに発現しないということもあります。手技的な部分は指導員と相談して解決してください。 ２、遺伝子の導入効率を疑う。 細胞と試薬が一緒でも遺伝子導入効率は大きく変わります。ですのでEGFP等の蛍光タンパク質を発現するプラスミドを導入するwellを用意し、蛍光顕微鏡等で光っている細胞の割合を確認するといいでしょう。この場合pTREに入れてあるEGFPよりも発現実績のある恒常発現型のプラスミドを用いましょう。Tetの系が動いているか分からない状態ですので蛍光が確認できなかった際にどちらの問題であったか分かりませんので。 ３、目的の遺伝子の性質と抗体を疑う WBに使用している目的のタンパク質に対する抗体がきちんと使えるものであるかは確認されていますでしょうか？ラボでそのタンパク質に対する研究実績があるのであれば抽出条件等は問題ないかもしれませんが、そうでなければ検討する必要があります。RIPAバッファーなどの抽出力（正しい表現ではないかもしれません）の強いものを用いたり、抗体のデータシートのポジコンの抽出条件等が参考になると思います。 さらに目的のタンパク質の安定性はいかがでしょうか？半減期が数分というタンパク質もありますので、ものすごいスピードで分解していて見えないのかもしれません。ドメイン解析などで短くしたコンストラクトで急激に不安定になることも多々あります（それでも一過性の発現では大概見えますが・・・）EGFPは細胞内ではかなり安定なタンパク質です。この辺もラボの研究実績次第ですが考慮してみてはいかがでしょうか？ 長くなってすみませんです。

(無題) 削除/引用 No.166-7 - 2011/03/18 (金) 02:06:07 - Boston-Pullman Lipofectamine 2000 (DNA ２ ug, Lipofectamine 6 uL in final 500 uL serum-free DMEM).６穴プレート１ウェル当りの分量です。 Transfection 自体はserum-free medium中で３時間、その後、serum-plus medium にてO/N。 翌朝、DOXを加えるといった感じです（私の場合はTet-On systemなので）。

(無題) 削除/引用 No.166-6 - 2011/03/18 (金) 00:49:44 - tet以前に 亜種にもよりますが、Helaは遺伝子導入がしにくい印象があります。 Clontechから購入したなら、たしかCHO-AA8のコントロール細胞がついてきていると思うのですが、CHO細胞は遺伝子導入しやすいので、CHO細胞を使えば2~4は簡単に確認できます。 CHOを使っても目的の遺伝子の発現が見られないなら、コンストラクトかWBの条件に問題があります。CHO細胞を使って発現誘導が見られるのであれば、Hela S3細胞へのtransfectionに問題があります。 もしくは、pTRE EGFPを導入した時に、EGFPの蛍光を顕微鏡下で確認しましたか？ もし、蛍光が見られないのであれば、transfectionの問題でしょう。 EGFPの発現を観察できたら、コンストラクトか、細胞の溶解とWBの問題です。 transfectionの条件検討は重要です。 もし手持ちであれば、TREではなくCMVなどのプロモーターで発現するGFPやRFPを用いて、自分が使う細胞に最適な条件を見つけてから本実験を行った方が、無駄がありません。

(無題) 削除/引用 No.166-5 - 2011/03/17 (木) 22:30:57 - 初心者 - Boston-Pullmanさん コメントありがとうございます。 pTRE2hyg EGFPのサンプルも同時にWBで確認しましたが、目的のサイズにバンドが見られませんでした。 Tet以前にtransfectionがきちんと出来てないのでしょうか。 LIPOFECT AMINEとPlus Reagentを用いてtransfectionしました。 エレクトロポレーションを用いてtransfectionするかどうか検討中ですが、Boston-Pullmanさんは、どのようにtransfectionされているのでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.166-4 - 2011/03/17 (木) 22:27:23 - 初心者 コメントありがとうございます。 1.transfectionの効率が悪い 2.発現ベクター（目的の遺伝子）が機能していない LIPOFECT AMINEとPlus Reagentを用いてtransfectionしました。 pTRE2hygというベクターを使っています。 コンストラクションには問題がないと思うのですが… pTRE2hyg EGFPのサンプルも同時にWBで確認しましたが、目的のサイズにバンドが見られませんでした。 3. 細胞の溶解条件が悪い クロンテック社の説明書に従って溶解しました。 ただ、普通のHela細胞と異なり、Hela S3 Tet offは丸い細胞でした。 4. WBの条件が悪い EGFPでWB確認した際に、ポジコンとして流したサンプルのバンドは、はっきりと確認できました。 EGFPではなくtransfectionした目的の遺伝子産物？を見ることのできる抗体でも確認しましたが、目的のサイズにバンドが見られませんでした。 やはり、transfectionの効率がかなり悪いのでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.166-3 - 2011/03/17 (木) 07:03:03 - Boston-Pullman 転写も起きてないとなると指摘されているように 1. transfectionの効率 を最初にチェックする必要があります（コンストラクションに問題ないとして）。 私は毎回ポジコンとしてTRE-EGFPのサンプルを用意して、システムに問題がないか確認しています。 急がば回れということです。

(無題) 削除/引用 No.166-2 - 2011/03/17 (木) 01:50:34 - tet以前に 1. transfectionの効率が悪い 2. 発現ベクター（目的の遺伝子）が機能していない 3. 細胞の溶解条件が悪い 4. WBの条件が悪い 上記の可能性についてコントロールをおいて確認しましたか？ したなら、その結果はどうでしたか？

Tet offシステム樹立 削除/引用 No.166-1 - 2011/03/17 (木) 00:41:41 - 初心者 大学4年生の者です。 Tet offシステム樹立のため、Hela S3 Tet off細胞株 (クロンテック社)を購入しました。 目的の遺伝子を導入したpTREベクターをHela S3 Tet off細胞株にTransfectionし、発現チェックのため、Doxを抜いてから（コントロールでDox有りのも同様に）72時間後に細胞を回収し、WBにより発現の有無を確認しましたが、誘導どころか、目的の遺伝子すらバンドが見当たりませんでした。 −−−−−− 培養条件：G418、誘導をかける時にTet専用FBS、Selectionにハイグロマイシン 発現チェックのため、PBS(-)で2度、Dox無の培地で1度洗浄してから72時間後に細胞を回収しました。 −−−−−− そこで、ハイグロマイシンの濃度を上げ、シングルクローンを獲得してから、上記と同様の方法で発現チェックを行いましたが、やはり、誘導どころか、目的の遺伝子すらバンドが見当たりませんでした。 どうしてなのか、全く分かりません。ご教授頂ければ、幸いです。 よろしくお願いします。

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