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in situ hybridization(AP発色)と蛍光免疫染色の二重染色 トピック削除
No.20-TOPIC - 2011/02/15 (火) 12:02:11 - kidokisk
いつもフォーラムにて勉強させて頂いております。ありがとうございます。

当方の研究室ではdopamine receptorと転写因子の局在が同じであると仮定して研究を行っております。

マウス脳(4%PFA灌流固定)サンプルにおいて、dopamine receptorをDIGラベルRNA probe(アルカリフォスファターゼ発色)にて検出しております。バックグラウンドも高くなく良好な発色です。ちなみに手順としては、
・脱パラ後、オートクレーブで賦活化し、PBS wash
・24hハイブリ
・SSC、ホルムアミドなどを含むwash液でwash
・DIG抗体をX5000で 1O/N 4℃反応、発色
です。

発色後、転写因子の蛍光免疫染色を以下の手順で行っております。
・TBST wash後2% Roche blocking bufferで1h blocking
・1st(X100)で 2O/N、4℃反応
・2nd(X500) ビオチン化マウス 1O/N 4℃反応
・AB Complex(X100)反応 1h RT反応
・TSA(tyramide-signal amplification system) 30min. RT反応
・Anti-dinitrophenyl-KLH-rabbit IgG fraction Alexa Fluor 488
conjugated(X500)にて 1O/Nで4℃反応後蛍光検出

この際、抗体希釈はblockingで使ったものと同じものを使用しています。ABはTBSで希釈しています。


何枚かを同時に染色すると、切片で蛍光が共局在して検出できるものと、蛍光が明らかに減退、消光しているものが見られます。

質問内容は、
・ISHのアルカリフォルファターゼ発色が強い場合、蛍光シグナルの検出が弱くなること、もしくは検出できなくなることがあるか
・賦活化の際、充分室温で冷却できていないままPBS washを行うと、転写因子の抗原性に影響が出るか

以上の2点です。長文で申し訳ございませんが、御教示よろしくお願いいたします。
　
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(無題) 削除/引用
No.20-2 - 2011/02/15 (火) 21:28:48 - Actias
そもそもで申し訳ないですが、どちらも蛍光ではダメでしょうか？
たとえば下記でぐぐる。
Simultaneous detection of RNA and protein

in situ hybridization(AP発色)と蛍光免疫染色の二重染色 削除/引用
No.20-1 - 2011/02/15 (火) 12:02:11 - kidokisk
いつもフォーラムにて勉強させて頂いております。ありがとうございます。

当方の研究室ではdopamine receptorと転写因子の局在が同じであると仮定して研究を行っております。

マウス脳(4%PFA灌流固定)サンプルにおいて、dopamine receptorをDIGラベルRNA probe(アルカリフォスファターゼ発色)にて検出しております。バックグラウンドも高くなく良好な発色です。ちなみに手順としては、
・脱パラ後、オートクレーブで賦活化し、PBS wash
・24hハイブリ
・SSC、ホルムアミドなどを含むwash液でwash
・DIG抗体をX5000で 1O/N 4℃反応、発色
です。

発色後、転写因子の蛍光免疫染色を以下の手順で行っております。
・TBST wash後2% Roche blocking bufferで1h blocking
・1st(X100)で 2O/N、4℃反応
・2nd(X500) ビオチン化マウス 1O/N 4℃反応
・AB Complex(X100)反応 1h RT反応
・TSA(tyramide-signal amplification system) 30min. RT反応
・Anti-dinitrophenyl-KLH-rabbit IgG fraction Alexa Fluor 488
conjugated(X500)にて 1O/Nで4℃反応後蛍光検出

この際、抗体希釈はblockingで使ったものと同じものを使用しています。ABはTBSで希釈しています。


何枚かを同時に染色すると、切片で蛍光が共局在して検出できるものと、蛍光が明らかに減退、消光しているものが見られます。

質問内容は、
・ISHのアルカリフォルファターゼ発色が強い場合、蛍光シグナルの検出が弱くなること、もしくは検出できなくなることがあるか
・賦活化の際、充分室温で冷却できていないままPBS washを行うと、転写因子の抗原性に影響が出るか

以上の2点です。長文で申し訳ございませんが、御教示よろしくお願いいたします。
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