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IFNgamma の効果 削除/引用 No.220-10 - 2011/04/06 (水) 23:37:04 - None ポン吉様、いろいろと丁寧に回答していただき、ありがとうございました。 無事（？）、iNOSの発現をNOの放出、さらにはWBで確認することができました。 ただ、ここでまた質問なのですが、 LPS単独での刺激とLPS/IFNgでの刺激を比較した場合、 iNOSの発現はどの程度増加するのでしょうか？ 現在、100ng/mlのLPSで刺激を行っているのですが、 おおくの論文で使用されている10U/ml, 100U/mlのIFNgでは、 LPS単独で刺激した場合と、それほどiNOSの発現量は増えてきません。 1000U/mlのIFNgを加えた場合のみ、1〜２割程度iNOSの増加がみられます。 IFNgammaの活性が落ちているかもしれないと考えています。 どのように、おもわれますか？ アドバイスよろしくお願いします。

IFNgamma no 削除/引用 No.220-9 - 2011/04/06 (水) 23:28:23 - None

(無題) 削除/引用 No.220-8 - 2011/03/31 (木) 00:17:03 - ポン吉 >RAW細胞を培養するさい、DMEMまたはRPMIをを使用している論文が多いのですが、どのように使い分けをしているのでしょうか？ LPS/IFNg刺激前後の差をはっきりさせたい場合、DMEMよりRPMIの方が バックグラウンドレベルでのRAW細胞の活性化が低いということはあるのでしょうか？ >現在はDMEMに非動化した１０％FBSを加えてポリDリジンコートした培養皿で継代していますが、継代時にトリプシン処置をしても、なかなか細胞がはがれません。長時間のトリプシン処置は細胞にダメージを与えそなので、避けたいと思っているのですが、RPMI培地に変えることで、解消されるのでしょうか？ このbiotechnical forumでもたびたび取り上げられてるRAW264.7の剥がし方ですね。 検索するとすぐ出てくるかと思いますが、多くの方がトリプシン処理ではなく、スクレーパーでかきとって、その一部を播種して継代、というのがコンセンサスのようです。確かATCCかどこかでもそれでメインテインするように、とのことだったかと。 すみません私は何も考えずRPMIで培養しておりました。 この辺は細胞購入先ATCCやRIKENのセルバンクを見るとどういった培地で飼う事が推奨されてるか書かれてあるはず。ただLPSでの反応を見たいときは？という問いへの答えは書かれてないと思います。

再び感謝です。 削除/引用 No.220-7 - 2011/03/30 (水) 21:31:53 - None ポン吉さま、 カタログ番号までわざわざ有難うございます。 このLPSをオーダーして、試してみます。 頼り切ってしまい申し訳ありませんが、もう少し質問があります。 RAW細胞を培養するさい、DMEMまたはRPMIをを使用している論文が多いのですが、どのように使い分けをしているのでしょうか？ LPS/IFNg刺激前後の差をはっきりさせたい場合、DMEMよりRPMIの方が バックグラウンドレベルでのRAW細胞の活性化が低いということはあるのでしょうか？ 現在はDMEMに非動化した１０％FBSを加えてポリDリジンコートした培養皿で継代していますが、継代時にトリプシン処置をしても、なかなか細胞がはがれません。長時間のトリプシン処置は細胞にダメージを与えそなので、避けたいと思っているのですが、RPMI培地に変えることで、解消されるのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.220-6 - 2011/03/30 (水) 19:48:48 - ポン吉 himawari様 ありがとうございます。早速呼んでみます。 None様 ＃L4391（Sigma） LPS from Escherichia coli 0111:B4 γ-irradiated, BioXtra, suitable for cell culture というのを私は使用しています。 もちろんRAW264.7を刺激して、サイトカインの産生なども見ていました。 血管内皮とは違い、マクロファージ系の細胞ではLPSだけでもNOを産生してくれるようですよ。 ただし、IFNgと一緒に刺激を行うとより多く産生されますよ。

ありがとうございます。 削除/引用 No.220-5 - 2011/03/30 (水) 18:20:58 - None himawariさま、ポン吉さま、アドバイスありがとうございます。 RAW細胞でのiNOSの発現誘導は簡単だと聞いていましたので、 ラボに残っていたLPSとINFgammaをとりあえずかけてみようと、 ほとんど下調べをせずに、研究をスタートしてしまいました。うかつでした。 プロダクトシートを読んでみたところ、IFNgammaは種間で大きく違い、種を合わせておくことが重要なことなど書いてありました。次はマウスのもので試してみます。 また、LPSも購入しようと思っているのですが、精製方法の違いによりいろいろな選択肢があることがわかりました。もちろん、値段も大きく異なります。 いろいろ文献を見てみたのですが、どのような精製段階を経たLSPを使用しているのかまでは、書いておらず、困っています。 実験の目的は、iNOSを誘導してNOを産生させることなのですが、どのレベルの精製状態のLPSを購入すればよいでしょうか？アドバイス、よろしくお願いします。

(無題) 削除/引用 No.220-4 - 2011/03/30 (水) 13:06:37 - himawari iNOSのアンチセンス転写産物による発現抑制はこの世界ではメジャーな話ですよ。 ちょっと探せばすぐ出てきます。 日本語の簡単な総説を紹介します。 http://wwwsoc.nii.ac.jp/jbiochem/magazine/80-08-05.pdf#search='立命館大学 西澤 iNOS'

(無題) 削除/引用 No.220-3 - 2011/03/30 (水) 10:56:23 - ポン吉 横から失礼します。 himawariさま >antisense iNOSによる発現抑制もあることが これにつき論文をご紹介いただけませんでしょうか？ Noneさま >�@RAW細胞がマウス由来のため、IFNgammaもマウスのものを使用しなければならないのでしょうか？（現在は、ヒト由来のものを使用しています。） >�ALPSは、大腸菌由来、サルモネラ由来のどちらが強くiNOSを誘導するのでしょうか？ >�B文献によっては、IFNbetaを使用しているものもありますが、betaとgammaどちらがよいのでしょうか？ おそらくこれらの質問は実験を立ち上げる前に調べておく必要があったと思います。 LPSの場合種特異性がありますし、IFNgもproduct sheetを見るか、過去の論文を調べれば分かると思いますよ。 それより私から一言。 iNOSのタンパク質の産生とiNOS mRNAの発現誘導とは相関性はあるんですが、かなり遅れます。 なのでmRNAでpeakの時期と同時期にタンパク質を検出しようとしても出来ませんでした。かなり遅れます。当然培地のNO産生も24-48hrsで検討していましたよ。 あとは、LPS 0.5 ug/mlとは少し多いかな？

(無題) 削除/引用 No.220-2 - 2011/03/30 (水) 08:40:04 - himawari 1. RAWはLPSの種類と精製度、濃度によって効きが違います。 いくつか条件を検討する必要があると思います。 LPSの濃度は1ug〜10ugの間で検討すべきだと思います。 また、antisense iNOSによる発現抑制もあることが数年前からわかっていますので、これから行うassay系がうまくいかなくなったらこのiNOS阻害機構を検討したらよいかも。 INF-gammaで効かないならTNF-alphaを試してみたらどうでしょうか。 2. 若干サルモネラの方が低濃度で効きますが、私は大腸菌由来を使います。

RAW264.7でのiNOSの発現誘導 削除/引用 No.220-1 - 2011/03/29 (火) 21:24:31 - None RAW細胞にLPSとIFNgammaで刺激して、iNOSの発現誘導をかけたいのですが、iNOSの発現が確認できません。iNOSが発現すると、培地が黄色くなるとのことですが、培地の色もコントロールと同じです。条件は以下の通りです。 LPS：500 ng/ml IFNgamma: 100 units/ml これらを80％コンフルエントになったRAW細胞にかけて、 24時間インキュベーションしています。 質問なのですが、 �@RAW細胞がマウス由来のため、IFNgammaもマウスのものを使用しなければならないのでしょうか？（現在は、ヒト由来のものを使用しています。） �ALPSは、大腸菌由来、サルモネラ由来のどちらが強くiNOSを誘導するのでしょうか？ �B文献によっては、IFNbetaを使用しているものもありますが、betaとgammaどちらがよいのでしょうか？ ご指導よろしくお願いします。

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