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(無題) 削除/引用 No.240-9 - 2011/04/01 (金) 22:27:17 - おお 220nmの領域で振り切れてしまっている可能性はないですか?

(無題) 削除/引用 No.240-8 - 2011/04/01 (金) 17:34:41 - yama 皆様、様々なアドバイスありがとうございます。 今わかったのですが、全然違うところが原因だったかもしれません。 220nm（おそらくペプチド結合による波長）に対して280nmの吸収が高すぎるということでしたが、 吸光度計がおかしい可能性が出てきました。 精製したサンプルを濃度依存的に吸収スペクトルを測定したところ、 280nmの吸収は濃度依存的に増減したのですが、220nmの吸収は一定の値を示しました。 220nmの吸収は、サンプルの濃度の増減に非依存的でした。 （サンプルの希釈に用いた溶液はどこにも吸収をもっていません） だから、220nmのところが正確に測定できていないのかもしれません。 うちの研究室のが故障しているのか、 nanodropで測定しているのですが、これ機械が220nm付近は信用できないという経験ある方とかいますか？

(無題) 削除/引用 No.240-7 - 2011/04/01 (金) 17:26:30 - yama 瞬さん、ありがとうございます。 やはり、界面活性剤が残る可能性は高そうですね。 界面活性剤を使わない精製方法を考えてみようと思います。

(無題) 削除/引用 No.240-6 - 2011/04/01 (金) 17:08:27 - yama atsさん、ありがとうございます。 以前、そうですよね、Triton X-100がミセルを形成して透析等で除けなくて苦労したことがあって。 最初の菌を破砕するときにのみTritonX-100を入れて、あとは、3種類のカラムの精製過程で除かれていると思っていたんですが。 それでもまだTriton X-100が残っている可能性もあるかもしれないですね。 検討してみます、ありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.240-5 - 2011/04/01 (金) 17:01:53 - 瞬 デタージェントは蛋白とくっつきやすいので、同じ吸収帯があればやはりそれの可能性が高いかと思います。透析では除けないのが普通です。 特に問題なければ、そのまま。 どうしても除く必要があれば、最初からそれを入れないことです。デタージェントとのあるなしで多少精製のときの挙動が変わるかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.240-4 - 2011/04/01 (金) 16:29:10 - ats Triton-X100のミセルは、透析では（完全に）除けませんよ。

(無題) 削除/引用 No.240-3 - 2011/04/01 (金) 15:09:55 - yama おおさん、さっそくの返信ありがとうございます。 やはり、Triton-X100やメルカプトエタノールは影響する可能性があるのですね。 すみません、わかりにくい文章でしたが、これらは精製過程では入れているのですが、最終的には、酢酸ナトリウムバッファーのみで透析して除いています。 だから、タンパク質に結合していなければ、酢酸ナトリウムとタンパク質以外は何も入っていないと思うのですが。 吸収スペクトルを測定すると220nmと280nmが同じくらいの高さで出てきてしまいます。色はついていなかったです。 ですので、聞きたかったのは、精製の過程でタンパク質に結合して一緒に精製されてくるような、280nmに吸収を示すようなものがあるのかということでした。

(無題) 削除/引用 No.240-2 - 2011/04/01 (金) 14:53:41 - おお Triton-X100は確かに280付近に高い吸収があると聞きますが、220あたりの吸収は存じ上げません。非常時強いのでブランクに同じ濃度のTriton-X100が入っていても可也ぶれないかと不安なのでわたしなら、違うでタージェンとをつかうかUVでの測定を諦めるかです。 メルカプトエタノールはちょっと思い出せませんがDTTも酸化すると280にえいきょうがあるようです。なので メルカプトエタノールもえいきょうがあるかもしれません。 スペクトルは測定してみたでしょうか?色はついてないですよね。。。多分ついてたらそういう相談はないかもしれませんね。コファクターなどの可能性も場合によっては考慮に入れてもいいかもしれません。

精製したタンパク質の異常な吸収スペクトル 削除/引用 No.240-1 - 2011/04/01 (金) 14:08:35 - yama 大腸菌で、発現させ精製したタンパク質のUVの吸収スペクトルを測定したところ、280nmの吸収が220nmの吸収よりも高いスペクトルが得られました。これにはどのような理由が考えられるのでしょうか？ 精製は、陽イオン交換カラム、ゲルろ過カラム等の3ステップで行っています。最後に、酢酸ナトリウムバッファーで透析しています。（ほかには何も入っていないです） 得られたサンプルは、SDS-PAGEで1バンドになるくらいにきれいになっています。 何か大腸菌の中の物質や精製過程で加えた物質が結合しているのでしょうか？ 精製過程で加えたもので、影響しそうなものとしては、Triton-X100、メルカプトエタノールくらいです。 考えられるものなどを教えていただけるとありがたいです。どうぞよろしくおねがいします。

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