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(無題) 削除/引用 No.272-24 - 2011/04/18 (月) 09:36:48 - ~ 間違ったといわれても… RNAがその状態でキアゲンのカラムに結合するかどうかは試したことがありませんが、 アルカリSDS法でSol.IのRNase±でプラスミド抽出すると、イソプロ沈の後の段階で、RNase−ではRNAが残存し、RNase＋ではRNAが検出限界以下です。 そのため、Sol.I（やP1）にRNaseを入れた場合に、そのRNaseの活性が見られなくなるというのであれば、それは間違いでしょう。

(無題) 削除/引用 No.272-23 - 2011/04/16 (土) 10:15:31 - おお ほんとに沈殿がありロスがどれだけあるかスペキュレーションのうちから間違った方法というのはどうかと思いますが、、、 RNAが入っていていけないかどうかは次のステップによります。制限酵素処理をするだけであればRNase抜きでミニプレップして、制限酵素処理の時にRNaseを入れれば言い訳で、その後バンドを見るとか、切り出すだけであれば分解された短いRNAやRNaseは入っていても電気えいどうはできます。 バクテリアにトランスフォーメーションしたり、PCR、コンストラクションを作ったりするのにはRNAやRNaseの多少の混入はほとんど問題がないと思います。そういう目的ならきっとを使わないRNase抜きで精製後RNase加えてもさらにフェのクロの必要がないかもしれません。フェのクロしても完全にRNaseが抜けてないかもしれませんよ場合によっては。またエタチンのキャリア-としてtRNAを加えることもあります。 それとカラムにのっける前に変性させるという意見がありますが、変性後リフォールディングするので意味がありません。またQIAGENのきっとは変性剤を使ってないイオン交換カラムの物もあります。 RNaseを加えないでカラムなどにのせた時の心配なのは、RNAもカラムに親和性がありますから、DNAと競合するばあいです。長いRNAほど吸着力が強くなりますから競合しやすくなります。

(無題) 削除/引用 No.272-22 - 2011/04/16 (土) 02:13:40 - Boston-Pullman > 簡単な話、RNaseなしで全行程をやっていみればいいのですが、みんな面倒なのでやらないだけだと思います。 > 私はうまくいくほうに賭けますね。 私はキット世代でないので、修士のときは自分で試薬を調製してミニプレップをしていました。そのときは、RNase を最後に加えていました。RNase なしでは、ボワッとしたRNAのバンドがはっきり見えますよ。 ラージはセシクロで精製したのでRNAのコンタミはなく、酵素処理は必要ありませんでしたが。 面倒だからやらないのは確かですが、キットを使いながらあえて除いてやる必要性はないですよね。

(無題) 削除/引用 No.272-21 - 2011/04/15 (金) 21:46:21 - ac 最適ではないですが合理的な方法だとは思いますが→Sol. IにRNaseを入れる 教科書的なアルカリ法だとRNaseをかけずにフェノクロ・エタ沈までやってTEに懸濁してからあらためてRNase処理ののちフェノクロ・エタ沈・・・ってめんどくさくてやってられませんよね。 RNase処理の効率といった観点からは無駄に大過剰加えていることになるので「間違った」方法でしょうけど、結果としてちゃんとRNAが除けているし、カラム精製のキットならたいていの場合binding solutionにグアニジンが大量に入っててその時点でRNaseの失活も望めるので、一石二鳥で悪くない方法だと思いますよ。

(無題) 削除/引用 No.272-20 - 2011/04/15 (金) 21:10:06 - 中年 「間違った」プロトコールというより、労力と得られる効果のバランスでsolution Iが選ばれているのでしょうね。 RNaseなしだと当然RNAのコンタミがありますよ。DNAと競合しかねないのでカラムのキャパシティーを十分に使いきれない可能性もあります（これは推測）。

(無題) 削除/引用 No.272-19 - 2011/04/15 (金) 17:50:56 - もっさん みなさん、たくさんのご意見ありがとうございます！ やはり最後のDNA標品にRNaseがコンタミしていることはないと思うので、 SDSによって一部あるいは全て沈殿していて、 さらにカラムによって全部除去できているということなんですね。 確かにwash bufferの塩濃度次第では、簡単に除去できそうですね。 そしてRNaseを懸濁bufferに加えておくのは、 やはりその保存状態のためという意見が個人的にはしっくりきた気がします。 しかしそれだとやはり間違ったプロトコールさんの言う通り プロトコールが間違っている、もしくは間違っていないまでも 少し効率の悪いプロトコールであるように感じてしまいます。 ところで最近知ったのですが、うちの研究室の少数派の人たちは BIO-RADプラスミド精製キットを用いており、 そのキットではどうやらRNaseを用いていないそうです。 なので当然RNAは最後までコンタミしっぱなしなのですが、 濃度を測定するときに、濃度を測定値より少し少なく見積もる程度で 他は特に気にすることなく実験を進めていらっしゃいます。 その後の実験次第ではありますが、もしかしたらRNAのコンタミは さほど気にすることでもないのかもしれないと考えさせられてしまいました…

(無題) 削除/引用 No.272-18 - 2011/04/15 (金) 16:56:03 - 間違ったプロトコール メーカーを擁護する理由付けがとても多いようですが、個人的には間違ったプロトコールだと思います。 SolIではメジャーには膜が壊れていないのだから、RNaseは効きようがありません。 その後、酵素に強力な変性剤を加えるのもおかしい。 簡単な話、RNaseなしで全行程をやっていみればいいのですが、みんな面倒なのでやらないだけだと思います。 私はうまくいくほうに賭けますね。

(無題) 削除/引用 No.272-17 - 2011/04/15 (金) 10:03:57 - ~ アルカリSDS法ではSOl.IにRNaseを加えずに、最後にRNase入りTEで溶かしている人はいます。 特別な手間をかけることなくRNase・RNAフリーの精製物を得られるのに、 わざわざRNAの分解産物とRNaseが残るようなプロトコルを提供する必要が無いからではないでしょうか。 モノマーのRNAがあると吸光度によるDNAの濃度測定も出来ませんよね。

(無題) 削除/引用 No.272-16 - 2011/04/15 (金) 09:16:15 - 中年 最後のDNA標品にRNaseのコンタミを無くそうとすれば、カラムに掛ける前に入れるしかありません。

(無題) 削除/引用 No.272-15 - 2011/04/15 (金) 08:38:00 - Actias RNase がタフなのは分かりました。 なぜ、最初に入れるのか？ なぜ、TEや水にプラスミドを溶かす直前ではないのか？ メーカーに聞けってことでしょうけど。

(無題) 削除/引用 No.272-14 - 2011/04/13 (水) 20:49:24 - 中年 一部は他のタンパク質と共に沈殿するでしょうけど、ここで加えているRNaseAの濃度はとんでもない大過剰なのでＯＫってことじゃないでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.272-13 - 2011/04/13 (水) 01:02:37 - Boston-Pullman >[Re:11] もっさんさんは書きました :、 > SDSが沈殿するときに、SDSが疎水性相互作用によって結合しているタンパク質もSDSと共に沈殿するということはないのでしょうか。もしそうならやはりP2を加えたときにRNaseが働いているんですかね？ RNase Aはカラムにかけたときの最初のflow throughに含まれていると解釈しています。学生には廃液の取り扱いに十分注意するよう言っています。

(無題) 削除/引用 No.272-12 - 2011/04/12 (火) 21:53:58 - マッキー RNaseを最初に加えておくのは、RNaseがいくらタフといえども、長時間アルカリや酸性溶液あるいはSDSにさらしておくのは良くないからじゃないんですかね

(無題) 削除/引用 No.272-11 - 2011/04/12 (火) 21:51:43 - もっさん Boston-Pullmanさん、おおさん、opsさん たくさんのご回答ありがとうございます！ ＞Buffer P3（酸性酢酸カリウム）で中和したときに、SDSは沈殿して、 溶液中でRNaseが働いている。 RNaseのリフォールディングは、かーーなり強力で、 たしか高濃度のUreaにさらして変性しても、 Ureaを除去すると、RNaseは元の構造に戻る すみません、完全に理解できていないのですが、 SDSが沈殿するときに、SDSが疎水性相互作用によって 結合しているタンパク質もSDSと共に沈殿するということはないのでしょうか。 もしそうならやはりP2を加えたときにRNaseが働いているんですかね？ あともう一つ気になったんですが、P2もしくはP3を加えたときに RNaseが働いてるんでしたら、なんで最初の懸濁bufferに RNaseを加えておくのでしょうか？ 質問ばかりして申し訳ないのですが、是非知恵を拝借したいです。

再度 削除/引用 No.272-10 - 2011/04/12 (火) 08:23:06 - Boston-Pullman >[Re:7] Boston-Pullmanさんは書きました : Sigma からの抜粋です。 > > RNase A is a single chain polypeptidecontaining 4 disulfide bridges. これゆえ、高次構造が強固に保たれているようです。逆に還元剤には弱そうですね。 > Activators of RNase A include potassium and sodium salts. アルカリバッファーにはナトリウムイオン、中和バッファーにはカリウムイオンが入っています。ちなみに、SDS-Na から不溶性の SDS-Kになることで、白い凝集体がゲノムDNAを巻き込んで沈殿します。 > Optimal temperature: 60 ℃ (activity range of 15ー70 ℃). At 100 ℃, an RNase A solution is most stable betwee､ﾕn pH 2.0 and 4.5. > > RNase A is stable to both heat and detergents. A major application for RNase A is the removal of RNA from preparations of plasmid DNA.

(無題) 削除/引用 No.272-9 - 2011/04/12 (火) 08:01:46 - ops QIAGENさんの見解です。 http://www.qiagen.com/plasmid/keysteps.aspx Buffer P3（酸性酢酸カリウム）で中和したときに、SDSは沈殿して、 溶液中でRNaseが働いている。 RNaseのリフォールディングは、かーーなり強力で、 たしか高濃度のUreaにさらして変性しても、 Ureaを除去すると、RNaseは元の構造に戻る、 というのが、 みんな持っていると思われる、大学生用の有名な教科書に載っていると思います。 おおこれかー、と座学（１年生時）と実地（４年生時）がつながった一つでした。

(無題) 削除/引用 No.272-8 - 2011/04/12 (火) 03:17:28 - Boston-Pullman I cannot type Japanese in my PC now, but it's not by virus. Sorry about that.

(無題) 削除/引用 No.272-7 - 2011/04/12 (火) 03:15:02 - Boston-Pullman ･ｷ･ｰ･ﾞ､ｫ､鬢ﾎ段ｻうﾇ､ｹ｡｣ｲﾎｿｼ､ﾞ､ﾇ､ﾋ｡｣ RNase A is a single chain polypeptidecontaining 4 disulfide bridges. ､ﾀ､ｫ､鬘｢ｸﾟｴﾎ�欽�､ｬｱﾀ､�､ﾋ､ｯ､､､ﾎ､ﾀ､ﾈﾋｼ､､､ﾞ､ｹ｡｣ﾄ讀ﾋ｡｢ﾟ�ﾔｪц､ﾋ､ﾏﾈ�､ｽ､ｦ､ﾇ､ｹ､ﾍ｡｣ Activators of RNase A｡｡include potassium and sodium salts. ･｢･�･ｫ･�･ﾐ･ﾃ･ﾕ･｡ｩ`､ﾋ､ﾏ･ﾊ･ﾈ･�･ｦ･爍｢ﾖﾐｺﾍ･ﾐ･ﾃ･ﾕ･｡ｩ`､ﾋ､ﾏ･ｫ･�･ｦ･爨ｬｺｬ､ﾞ､�､ﾆ､､､ﾞ､ｹ｡｣､ﾁ､ﾊ､ﾟ､ﾋ｡｢SDS-Na ､ｬｲｻﾈﾜﾐﾔ､ﾎSDS-K､ﾋ､ﾊ､ﾃ､ﾆｰﾗ､､ﾄ�ｼｯﾌ螟�ﾐﾎｳﾉ､ｷ､ﾆ｡｢ｴ�､ｭ､ﾊDNA､�紙､ｭﾞz､ﾟ､ﾊ､ｬ､鯔�ｵ�､ｷ､ﾞ､ｹ｡｣ Optimal temperature: 60 ｡紊 (activity range of 15ｨC70 ｡紊). At 100 ｡紊, an RNase A solution is most stable betwee､ﾕn pH 2.0 and 4.5. RNase A is stable to both heat and detergents. A major application for RNase A is the removal of RNA from preparations of plasmid DNA.

(無題) 削除/引用 No.272-6 - 2011/04/11 (月) 23:28:09 - おお ＞RNaseはタフです。 これはRNaseはSDSにさらした後でも 十分に活性を持っているということなのでしょうか。 変性後もリネーチャーするといわれています。高濃度ではたぶん1%とかでは活性がないと聞いたことがありますので、中和(酸性に偏ってSDSが沈殿する)かエタチンのあとの持ち込みでも聞いてるかもしれません。 http://www.sciencedirect.com/science?_ob=ArticleURL&_udi=B6TFS-4GBWJB2-2&_user=1458830&_coverDate=07%2F10%2F2005&_rdoc=1&_fmt=high&_orig=gateway&_origin=gateway&_sort=d&_docanchor=&view=c&_searchStrId=1713940455&_rerunOrigin=google&_acct=C000052790&_version=1&_urlVersion=0&_userid=1458830&md5=8748b943730733e658746786856592b5&searchtype=a この論文によるとpH10ではSDSが可也入っていても安定そうですね。。。

(無題) 削除/引用 No.272-5 - 2011/04/11 (月) 22:30:33 - 同じく いつRNaseが働くか、やっぱり不思議ですよね。 また、RNaseに対するSDSの効果としては Structure and Activity of RNase A in Sodium Dodecyl Sulphate Solutions と言うタイトルの論文があるようですが、読む事が出来ませんでした。 もし、どなかか可能ならば、RNaseありなしとかで各ステップのフラクションをアガロースゲル電気泳動にかけて確かめて欲しいです。（そんな暇な人はいないですね・・・。）キアゲンなどメーカーにはそのようなデータもきっとあるんでしょうね。

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