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(無題) 削除/引用 No.304-10 - 2011/04/18 (月) 22:10:41 - おお >[Re:9] ぱぐさんは書きました : > ウイルス蛋白に対する抗体を作成したいのです。 > 抗体はウエスタン、蛍光抗体法などに用いる予定です。 > 糖修飾などのバクテリアでは起こらない修飾など視野に入ってますか? そうでなければバクテリアでりこんびなんとを作るのが一般的ですが。あるいはペプチドとか。 細胞内外のプレディ区ションのWEBベースのものがあります。ちょっとリンクすぐにはでません。

(無題) 削除/引用 No.304-9 - 2011/04/18 (月) 21:44:21 - ぱぐ ウイルス蛋白に対する抗体を作成したいのです。 抗体はウエスタン、蛍光抗体法などに用いる予定です。

(無題) 削除/引用 No.304-8 - 2011/04/18 (月) 21:41:47 - ぱぐ >プラスミドを投与して、そのプラスミドの遺伝子を動物内で発現させて、そのたんぱく質にたいする抗体を作るならプラスミド自体は抗原にならないでしょう。 すみません。言葉の使い方が間違っていました。 タグを付ける方向でやってみようかと思います。 無知で恥ずかしいのですが、細胞外領域、細胞内領域などはどうやって調べたらいいのでしょうか？ そもそも細胞外領域という言葉自体なんとなくしか理解しておらず・・・ 簡単なことすぎるのか、調べてもなかなか見つかりません。 遺伝子解析ソフト等でわかるものでしょうか・・・

(無題) 削除/引用 No.304-7 - 2011/04/18 (月) 21:40:23 - Actias 抗体は何のために作るのでしょうか？ 作った抗体を使う（ウエスタンとか免疫染色とか）のでしょうか？ 抗体を産生させることそのものが目的でしょうか？ たとえばがん患者の血清中には、新たに作られた抗原、すなわちできたがんが抗原となることが考えられ、SEREX法というがん抗原遺伝子の同定法があります。そういうことをしたいのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.304-6 - 2011/04/18 (月) 03:29:50 - Boston-Pullman タグをつける以外に現実的なアイディアが浮かばないです。付けると仮定して、くれぐれもシグナルペプチドをつぶさないように。おおさんもすでにご指摘ですが、安全な場所に（少なくとも細胞内ドメイン）にタグを付けるべきです。 実験デザインに関してですが、私ならば細胞内ドメインを GFP に置き換えて、GFP 陽性ハイブリドーマ細胞をインジェクションします。免疫させたいのは細胞外ドメインなので。

(無題) 削除/引用 No.304-5 - 2011/04/17 (日) 11:39:40 - おお >プラスミド自体を抗原にする予定です。 プラスミドを投与して、そのプラスミドの遺伝子を動物内で発現させて、そのたんぱく質にたいする抗体を作るならプラスミド自体は抗原にならないでしょう。 プラスミドをインジェクションして発現させるというのがどの程度確立しているか分かりませんが、確かにそういうアイデアもあったような気がします。 細胞表面に出ていることが前提なら、サイトゾリックのドメインにタグを入れるのが一番確実かと思います。 どうしてもタグが邪魔になるなら、開始コドンから離れたところ(c末で問題なければそれがらく)にタグをいれて発現をみて、実際に動物に使うのはそのプラスミドからタグを除いたもの(そのほかは一切いじらない)をつくるというのもやり方かもしれません。 ATG以下のアミノ酸を変更したということについては、そこの配列がたんぱく質にとってどの様に重要かに左右されると思います、局在活性その他に影響をあたえる可能性がないか、影響を与えてたとしてあなたの実験にクリティカルかどうか。発現するかどうかよりそちらのほうが心配じゃないですか? 発現については直接的ではないですけど、in vitro translationでtranscriptがちゃんと翻訳システムに認識されるかをみる手はあると思います。

(無題) 削除/引用 No.304-4 - 2011/04/17 (日) 10:42:48 - ぱぐ >Boston-Pullman さん 発現したタンパクを抗原にするのではなく、プラスミド自体を抗原にする予定です。動物の体内で発現してもらう予定なのですが・・・ >おおさん そういうことになると思います。

(無題) 削除/引用 No.304-3 - 2011/04/17 (日) 09:27:16 - おお 細胞表面に露出する部分に対する抗体を作りたいということでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.304-2 - 2011/04/17 (日) 01:03:26 - Boston-Pullman >[Re:1] ぱぐさんは書きました : > 抗体作成のために作ったため、発現を確認したくて細胞にトランスフェクションしても蛍光抗体法やウエスタンはできません。このような場合どのように確認すればよいのでしょうか？確認せずに動物に免疫しはじめても大丈夫なのでしょうか？ 確認できたとして、どうやって免疫用抗原としての発現タンパク質を調製する予定ですか？タグがついていないと難しい気がします。タグがあれば、抗体で発現確認できますし。 実験デザインが見えてこないので、もうちょっと詳しい説明が必要かと思います。

pcDNAによるDNA免疫の発現確認 削除/引用 No.304-1 - 2011/04/17 (日) 00:05:47 - ぱぐ 初心者です。すみません。 今、抗体作成のためpcDNAに目的の配列をインサートしたものを作成しました。 抗体作成のために作ったため、発現を確認したくて細胞にトランスフェクションしても蛍光抗体法やウエスタンはできません。このような場合どのように確認すればよいのでしょうか？確認せずに動物に免疫しはじめても大丈夫なのでしょうか？ 心配なのが、kozac配列を入れるためにATGのあとに本来と違うアミノ酸を1つ入れたことです。その後このフォーラムを見ていたら、ATGの前はkozacにするけど、後は配列をかえるくらいなら入れないという人が多くて心配になりました。 先生のすすめでしたので先生にも聞きづらく、こちらで質問させていただきました。お願いします。

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