全19件 ( 1 〜 19 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

ありがとうございます 削除/引用 No.305-19 - 2011/04/20 (水) 21:04:23 - ほたるとかりん 沢山のアドバイス・御意見ありがとうございます。 別の大学のサザンに精通した先生に写真を見て頂き、電話で相談させて頂きました。 実際は直接修行に行くのが一番いいとは思いますが場所上の関係でしばらく自分で試行錯誤していくつもりです。 まずはプローブのラベリングから別方法で行う予定です。 結果が少し変わりましたらまた御相談になるかもしれませんが、報告させて頂きます！

(無題) 削除/引用 No.305-18 - 2011/04/19 (火) 09:54:44 - おお >[Re:17] JHさんは書きました : > 皆さんの活発な議論に水を差すようで申し訳ありませんが、non-RIのサザンブロットは32Pを使用したサザンより格段に難しい印象があります。 確かにそうですね。 > ラボに経験がないということですので、今の方法を自分で改善していくのは困難ではないでしょうか。私見ですが、RIの取り扱いに習熟されているのであれば32Pを用いた方法に変更する方が良いかと思います。 > RI、non-RIのいずれにしても、経験のある方もしくは実際にサザンブロットを行っているラボにお願いして直接教えてもらう必要があると思います。 ここら辺は投稿者の判断に任せましょう。やはりワークしているところから教えてもらうのがはやいとおもいますのでいい助言かとおもいます。ただ、将来研究者になる方であればやったことのない方法を始める時なにが重要なポイントになるか、結果を得るためには何を探らないといけないかなど考えてほしいとおもいます。それによって解決していける人でないと研究するには物足りないかという勝手な個人的な持論ですけど。とりあえず結果第一の状況ならそこまでは必要ないかと。

(無題) 削除/引用 No.305-17 - 2011/04/19 (火) 09:24:38 - JH 皆さんの活発な議論に水を差すようで申し訳ありませんが、non-RIのサザンブロットは32Pを使用したサザンより格段に難しい印象があります。ラボに経験がないということですので、今の方法を自分で改善していくのは困難ではないでしょうか。私見ですが、RIの取り扱いに習熟されているのであれば32Pを用いた方法に変更する方が良いかと思います。 RI、non-RIのいずれにしても、経験のある方もしくは実際にサザンブロットを行っているラボにお願いして直接教えてもらう必要があると思います。

(無題) 削除/引用 No.305-16 - 2011/04/19 (火) 09:19:43 - ~ ネガコン無しでも実験できますけど、 わざわざ欠失の報告が多い遺伝子と言っていますので、入手は容易ではないかと。

(無題) 削除/引用 No.305-15 - 2011/04/19 (火) 05:56:48 - おお 少なくともプローブように増幅したDNA配列は分かりますよね。間にイントロンがあったとしても配列読めば良いわけですし。 その配列を犬ゲノム(不完全だけどプロジェクトははしっていると思う)とブラストかけてみて強いホモロジーがあるか見てみるというチェックはできますね。あとCAの繰り返しとか人では出てきますが、プローブの配列が分かっているか読めるわけですから、そういう単純な配列はさけれますよね。イントロンの3'側はTCストレッチがあって、ほとんどのイントロンにあるのでノンスペの原因になる可能性はありますが、プローブの全長の長さのバランスで排除できる可能性もあります。 イントロンはアルー(様)配列など保存された配列もありますが、比較的配列の拘束が緩いので、ランダムに変異が入りやすいと考えるとイントロンの配列が比較的多様性がないというのは言いにくいです。気をつけるべく保存された配列があるとはいえるでしょうけど、それはエクソンにもそういうのがありますし、エクソンにもくり返し配列が出てくるのも事実です。

(無題) 削除/引用 No.305-14 - 2011/04/18 (月) 22:58:31 - AP そうそう、 ゲノムサザンて、塩基配列未知、エクソンイントロン構造未知であろうと、またそれを調べるのすら容易でなかった時代から、制限酵素消化パターンでゲノム構造をキャラクタライズしたり、ことなる遺伝子型間で比較をしたりするのに、ずっと使われてきた手法ですから。 ネガコンとか、イントロンのプローブとか、あんまり本質的ではないんじゃないかと思います。

(無題) 削除/引用 No.305-13 - 2011/04/18 (月) 21:31:57 - おお ネガコンってそんなに神経質になる必要あるかなぁと個人的におもうのですが。そもそもサザンが確立された時にはトランスジェニックの技術もなく欠損したものなんて手に入らない状況だったはず。 近いプロ-ブで同じパターンが得られると、特異性をサポートできるとも思える。

(無題) 削除/引用 No.305-12 - 2011/04/18 (月) 16:25:46 - ~ イントロン配列に特異性が低く、非特異的に様々な遺伝子配列に結合してスメアになったような気がします。 >ネガティブコントロールに関して知識がなく用いていませんがどのように設定すべきなのでしょうか？ 例えば、その遺伝子についての欠失が確認できている腫瘍細胞を用意し、そのゲノムDNAを一緒に流しておくと、 貴方の興味のある細胞株ではバンドになって、欠失している細胞では検出されないはずですよね。 それがネガティブコントロールです。ネガティブコントロールの結果がポジティブになってしまった場合、系のどこかに問題があるという結論が得られます。 制限酵素量は1μgのDNAにつき1uを加えています。 １マイクログラムDNAあたり１ユニットを加えているのでしょうか？ 泳動してスメアになっているということで、このステップでは問題は起きていないのかもしれませんが、ここまで節約しなくてもいいのではないかと思います。 １マイクロリットル加えているのであれば、メーカーによって１マイクロリットルあたりのユニット数は異なりますので、トラブルシューティングのために出す情報としては足りません。 （EcoRIとBamHIはどのメーカーも濃いものを売っているので、十分量ではあると思いますけどね）

(無題) 削除/引用 No.305-11 - 2011/04/18 (月) 15:46:02 - Boston-Pullman 欠失のないポジコンのDNAが必要です。 あと、ポジコンのプローブでスメアとの事なのですが、ポジコンのプローブがワークするものである事はどの様にして確認しましたか？論文で使われているものでしょうか？ O/N での star 活性が気になります。処理後のDNAを鋳型にして、プローブ作製用プライマーでPCRする事をお勧めします。

(無題) 削除/引用 No.305-10 - 2011/04/18 (月) 15:37:33 - AP >目的とするプローブは3つの遺伝子を上流と下流からはさむように とは、どういうことなのかよく理解できませんが、 >イントロン内に設定しましたが、いくつかのExonをまたがるようにcDNA配列から作成する方が特異性が高いと言われ、作成しなおす事としました。 これはreasonableです。 イントロンはcomplexityが低い（AT-richだったり、mononucleotide-repeatなどが多くて複雑性が低い）ので、しばしばcross -hybridizationを起こしてスメア状やラダー状の像になります。ただし、必ずそうなるというわけではないですし（ゲノムシークエンスが既知の生物種なら、プローブとして選んだ配列がクロスするかどうかは相同性検索などでかなり見当がつきます）、またいくつものエクソンを含まなくても、シングルエクソン程度のプローブでも感度的には十分ではありますが。 reasonableではありますが、この場合、効果があるかどうかは？ なぜならエクソン配列をプローブにしたコントロールも同様の結果だというので。 >DNAの消化はEcoR�TとBamHIをもちいて37℃overnightで行いました。 制限酵素量は1μgのDNAにつき1uを加えています。 教科書通りですが、これで完全消化するとはかぎりません。たとえば、ゲノムDNAで10 ugという大量であれば、DNAの精製度、DNA溶解の不完全、あるいは粘性などによって制限酵素が非常に効きにくくなります。対策については過去トピに。 ゲノムサザンは適切に行えば、ほ乳類ゲノムでも0.5 ug程度でシングルコピーが検出できます。むしろ多すぎると上に書いたようなトラブルのもとです。 また、今見えているスメアというのがうっすらとしか見えないものでしたら、いろいろなステップで効率を損失しているのでしょう。これについても過去トピ参照。

(無題) 削除/引用 No.305-9 - 2011/04/18 (月) 15:01:14 - ほたるとかりん ゲノムの制限酵素処理は、電気泳動前に37℃overnightで行いました。

(無題) 削除/引用 No.305-8 - 2011/04/18 (月) 14:43:35 - in situ 書いておられるプロトコルだと制限酵素処理のステップが見当たりませんが、やっていますか？

ありがとうございます 削除/引用 No.305-7 - 2011/04/18 (月) 14:41:06 - ほたるとかりん 沢山のアドバイスありがとうございます。 初心者のため色々情報が足りず申し訳ありません。 スメアのシグナルはそれほど強くなく中にはバンドは認めませんでした。 DNAサンプルは腫瘍細胞株からキアゲンのDNA blood mini kitを用いて抽出しました。 目的とするプローブは3つの遺伝子を上流と下流からはさむようにイントロン内に設定しましたが、いくつかのExonをまたがるようにcDNA配列から作成する方が特異性が高いと言われ、作成しなおす事としました。 ポジティブコントロールは腫瘍において欠失の報告がなく別の染色体に位置する遺伝子のexon内に設定、正常DNAを用いてPCRにて増幅したものを用いました。 ネガティブコントロールに関して知識がなく用いていませんがどのように設定すべきなのでしょうか？ DNAの消化はEcoR�TとBamHIをもちいて37℃overnightで行いました。 制限酵素量は1μgのDNAにつき1uを加えています。 アドバイスよろしくお願いします。

(無題) 削除/引用 No.305-6 - 2011/04/18 (月) 12:33:49 - AP 実際の画像も見ず、それだけの情報でははっきりしたことはいえないですが、 そういうトラブルでよくあるのは、ゲノムDNAが完全消化しきれていないというのが原因です。過去トピにも書きました。

(無題) 削除/引用 No.305-5 - 2011/04/18 (月) 08:55:17 - ~ >ターゲットプローブもコントロールプローブも、スメア状に検出されました。 そのプローブで検出を行なったサンプルは何ですか？ 目的のサンプル 目的配列を含んでいることが確認できているポジコン プローブをゲノム1コピー、2コピー分流したもの などが並んでいれば、スメアに検出されているのが目的配列なのか、他の配列との非特異的な結合なのかが分かると思います。

(無題) 削除/引用 No.305-4 - 2011/04/18 (月) 07:55:40 - nana 本題とは直接は関係ないのですが 私は、電気泳動のゲルにはエチブロ入れず 泳動後に染めるようにしています。 検出されるバンドのサイズが不正確になるので。

(無題) 削除/引用 No.305-3 - 2011/04/18 (月) 04:07:49 - Boston-Pullman >[Re:1] ほたるとかりんさんは書きました : > エチブロを含んだゲルで電気泳動し、泳動後UVにて ポジコン、ネガコン用プローブ、DNAサンプルに関して、この位詳しい情報がほしいです。

(無題) 削除/引用 No.305-2 - 2011/04/18 (月) 03:43:01 - おお いろいろな可能性があると思いますので、ちゃんとした解決方法を提示できるか分かりません。くわえて、方法論も可也複雑な手技です。 酵素消化(場合によってはDNAの分解)、プローブのでき具合、プローブの配列が適切(これは手探りの場合もたたあります)。など考慮に入れるべきパラメーターはおおいです。過去のとぴでも話題が上がっていますので１度探されてみてはとおもいます。 すメアーであると言う事はやはりノンスペをひろっていると思います。もしそのシグナルが強いなら、ハイぶりの温度など調整して見るのはありかと思いますあるいは洗いを厳しくするか。 すメアーのシグナルが弱いなら条件を厳しくするとさらに弱くなるわけですからスペシフィックなバンドは検出は難しいかもしれません。そういう場合ならプローブをちょっと違う位置で作ってみるのが私はいいと思います。ちょっとした工夫、ハイぶり用バッファーの変更などでドラスティくに変わることもありますが、これも不確定な要素がおおいので私はあまりやらないかもしれません。

サザンブロットに詳しい方お願いします 削除/引用 No.305-1 - 2011/04/17 (日) 21:14:45 - ほたるとかりん ある細胞株において、同じ染色体に座位し、30kbp内に並んでいる数個遺伝子の発現がRT-PCR法にて検出できずそのゲノムの欠失を疑って、サザンブロットを始めました。 用いている細胞株は犬の腫瘍細胞株で、ヒト腫瘍でその遺伝子の欠失は多く報告されているので、欠失の可能性は高いと考えています。 ハイブリの後、ターゲットプローブもコントロールプローブも、スメア状に検出されました。 確実なバンドは見えませんでした。 これはどういう意味を表しているのでしょうか。 ハイブリ温度を検討すべきか、プローブをつくり直すべきか、それとも他の意味があるのでしょうか。 この様な現象は皆様も体験しているのでしょうか。 用いているのはロシュのDIG high prime DNA labelling and getection starter kit �Uで、洗浄なども全てロシュのbufferを用いています。 プローブのラベリング効率も説明書に従って確認しました。 ハイブリのプローブ量も説明書に従って行いました。 泳動したゲノム量は１レーンに10μgずつ、エチブロを含んだゲルで電気泳動し、泳動後UVにてゲノムが流れてスメア状になっていることは確認しています。 ラボにサザンを行っている人がいなく、トラブルシューティングができず困っています。 サザンブロットにお詳しい方、どうかアドバイスよろしくお願いします。 また何かサザンに関するよい参考書やサイトなどあれば教えて下さい。

全19件 ( 1 〜 19 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

パスワードを入力してチェックした記事を

チェックした記事を

このトピックにメッセージを投稿する 名前  メール  　アドレス非公開    タイトル  本文       設定  クッキーを保存（次回の入力の手間を省けます） 上に上げない（トピックの一覧で一番上に移動させません） 解決（問題が解決した際にチェックしてください） 暗証  半角英数字8-12文字の暗証番号を入れると、あとで削除、修正ができます。 送信

---

〔使い方〕 「アドレス非公開」をチェックすれば、自分のメールアドレスを公開しないで他の方からメールを受け取れます。 問題が解決した際には、解決ボタンをチェックして解決した旨のコメントをつけてください。これは、初めにトピックを作った人と管理人のみが可能です。 半角カタカナ、機種依存文字(全角ローマ数字、○の中の数字等)は文字化けの原因となりますので使わないでください。

---