BioTechnicalフォーラム [RNA前駆体も逆転写されてしまうのでしょうか。(RealtimePCR)]

RNA前駆体も逆転写されてしまうのでしょうか。(RealtimePCR)

No.309-TOPIC - 2011/04/19 (火) 10:47:02 - 素人太朗

卒論研究の学部生です。

培養細胞に薬剤を添加し、遺伝子変化をリアルタムＰＣＲ法で調べる実験を行っています。

方法として、

抽出：ＩＳＯＧＥＮ　→　DNase処理　→　フェノールクロロホルム抽出
逆転写酵素：タカラ社 PrimeScript RT Master Mix
リアルタイム：タカラ社　サイバーグリーン試薬　SYBR Premix Ex Taq

を、指示されました。

この逆転写酵素なのですが、メーカー説明書によると
「定量RT-PCR の逆転写反応に必要なコンポーネント（PrimeScript RTase、RNase Inhibitor、Random 6 mers、Oligo dT Primer、dNTP Mixture、反応バッファー）を
すべて含んだ5×濃度のプレミックス試薬であり、鋳型RNAと水を添加するだけで迅速に反応を開始できる。
本製品により得られたcDNAは、SYBR Greenアッセイ、TaqManプローブアッセイのどちらにも利用できる。」

とのことです。

ここで些細な疑問が生じたのですが、上記方法で採取した鋳型RNAにはスプライシングを受けていないRNA前駆体も含まれていますよね？
Random 6 mers、Oligo dT Primerで、RNA前駆体も逆転写されてしまうことはないのでしょうか。

素人質問で申し訳ありませんが、羊土社の書籍を読んでも参考になりそうな記事を見つけることができませんでした。
もしよろしければ教えてください。
　

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No.309-6 - 2011/04/21 (木) 08:55:21 - 素人太朗

皆様、親切に教えてくださってありがとうございます。

とても勉強になりました。

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No.309-5 - 2011/04/20 (水) 04:26:49 - 310

Boston-Pullman様と同じ意見になるかもしれませんが、あまりに気になるようであれば、エクソンの継ぎ目をまたぐようにしてプライマー設計するといいでしょう。それからSYBRの場合プライマーダイマーやエクストラバンドもシグナルに入ってしまうので、最初と微量サンプルを扱ったとき、増幅効率を求める検量線がうまく引けないときなど、ゲルで電気泳動して確認するといいでしょう。

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No.309-4 - 2011/04/19 (火) 22:16:06 - Actias

イントロンを含むmRNAは、転写後すぐにイントロンが切り出され、長くは存在していません（イントロンなしのmRNAになっちゃうので)。
それを逆手にとって、イントロンをプローブにしたin situハイブリダイゼーションで、転写後すぐのmRNAを検出する技があります。
RT-PCRでも使えるかも。

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No.309-3 - 2011/04/19 (火) 11:45:08 - Boston-Pullman

そのために、PCR プライマーを設計するとき、わざとイントロンを挟むようにするわけです。イントロンは長ければ長いだけいいです。

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No.309-2 - 2011/04/19 (火) 10:55:29 - おお

基本的にどんなRTのシステムをつかっても、mRNA以外のRNAも逆転写されます。プライマーがRNAにつくかどうかだけです。ランダムヘキサまあーをつかうとtRNAとかも逆転写されます。pre-mRNAは量的には少ないですが電気えいどうで流してもものによってはひっかかる事はあります。