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ありがとうございました 削除/引用 No.31-6 - 2011/02/24 (木) 21:05:44 - ハイジ ＞改良するなら　さん アドバイス頂きありがとうございました． お返事が遅くなって申し訳ありません． アルギン酸Naの遠心を入れ，水洗を除いた方法でもう一度やってみることにしました．仰る様に，細胞が収縮しているのは水洗のせいだと思いますので（トリプシンで消化すぎた感じではありませんでした） 実は添付していただいた資料も知りませんでしたのでとても参考になりました．どうもありがとうございました！またお尋ねするかも知れませんがよろしくお願いします．

(無題) 削除/引用 No.31-5 - 2011/02/19 (土) 03:48:44 - 改良するなら アルギン酸ゲルはEDTAなどで処理しないと壊れないので、染色中になくなるとは考えづらいです。 アルギン酸ゲル自体のバックグラウンドが気になるなら、アルギン酸を加えた後に遠心して、残ってるアルギン酸だけでゲル化して固めた方がバックグランドは抑えられると思います。 細胞が萎縮しているのは、水で洗ったからだと思ったのですが、どうでしょうね。 トリプシン処理は、血清入りの培地で中和していれば、多くの細胞は特に問題なさそうです（細胞によりけり）。 ご存知かと思いますが、参考までに。 http://www.tech.eng.kumamoto-u.ac.jp/work/report2009/resume_pdf/sougou_giken/P20_nakagawa.pdf

パラフィン包埋です 削除/引用 No.31-4 - 2011/02/18 (金) 08:50:28 - ハイジ ＞taniさん，改良するならさん メッセージありがとうございます．説明不足ですみません． 包埋はパラフィンです． 1x10^6個の細胞にAN150μＬを入れた後，塩化カルシウムを数点滴下し固化しました．参考資料によって遠心をやったりやらなかったりしていたので今回は省いたのですが遠心した方が良いでしょうか？ 水洗は，組織ブロックを作る際にホルマリンを洗い流すためにやっているステップなのですが今回は不要だったかもしれません． 更に質問で恐縮ですが，ANは染色する間になくなるもの（パラフィンの様に）ではないのでしょうか？また細胞回収ですがトリプシンだと強すぎる可能性はありますか？細胞を扱った経験が少なく，ラボにも聞ける人が殆ど居ませんので教えて頂けたら嬉しいです． よろしくお願いします．

(無題) 削除/引用 No.31-3 - 2011/02/18 (金) 05:51:27 - 改良するなら 6~8でしょうか。 濃度は書かれていても、量が書かれていないのでよくわかりません。 ANを入れた後遠心してますか？ 水で一晩洗う必要性は？

(無題) 削除/引用 No.31-2 - 2011/02/18 (金) 01:28:35 - tani �G一晩水洗後，定法で包埋 これ以下の定法と言うのは何ですか？ それと免疫染色のポジコンという話ですが、普通の組織学的な免疫染色のイメージからすると 理解しかねるステップもあります。パラフイン包埋法でしょうか、凍結による方法でしょうか、 それ以外による方法でしょうか、その辺あたりを教えてください。

セルブロックの作り方 削除/引用 No.31-1 - 2011/02/17 (木) 17:27:18 - ハイジ 免疫染色のポジコンとしてセルブロックを作りましたが細胞が萎縮している（トリプシン処理が長い？），バックグラウンドにANが残っているなどあまりキレイなものではありませんでした．改良したいのですが何処がポイントでしょうか？ご教示頂ければ幸いです． �@ヒト株化細胞（標的タンパク質の発現が確認されたもの）を培養 �A0.25%トリプシン-EDTA処理（〜5分），回収 �B遠心（1000rpm，5分），上清除去 �C10％中性緩衝ホルマリンで固定（室温3時間） �D遠心（同上），ホルマリン除去 �E1％アルギン酸ナトリウム（AN）でペレットを懸濁 �F10％塩化カルシウムで固化 �G一晩水洗後，定法で包埋

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