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(無題) 削除/引用 No.325-7 - 2011/04/22 (金) 13:59:26 - 大腸菌 培養は一晩行い、ﾌﾟﾚｰﾄに抗生物質は入っておりません。 ﾌﾘｰｻﾞは最近新しく購入したものでして故障は考えにくいですが、 もしかしたら他の研究者が頻繁に開け閉めしていることに原因があるのかもしれません。 おっしゃるように、プレートに全量を撒くか、LB液体培地に全量を放り込むかして、 培養し直してみたいと思います。 とても参考になりました。 また質問させていただくことがあるかもしれませんが、その際はよろしくお願い致します。

(無題) 削除/引用 No.325-6 - 2011/04/22 (金) 13:22:15 - AP >きちんと菌液の濃度を測定してｽﾄｯｸするべきだったのでしょうか？ 濃度を測る必要はないですが、ふつう定常期まで培養したo/n cultureをつかいます。もし、うっすらにごった程度でしたら用意に死に絶えても不思議ではありません。

(無題) 削除/引用 No.325-5 - 2011/04/22 (金) 13:15:54 - AP グリセロールストックは、しばしば死に絶えることがあります。 安定した超低温に入れっぱなしならそんなことはないんだと思いますが、普通に実験室のフリーザーだと出し入れ、開け閉めや、故障でそうもいかないためではないかと思います。 グリセロール濃度は低めのほうが、解けにくく長期間安定に保てるようです。 用いられる濃度は10%程度から50%まで幅広いですが（たしかMolecular Cloningでは15%）、私に手では10%あるいは7.5%くらいが調子いいようです。 生えてこなくなったストックは、しょうがないので全量、液体培地に放り込んで培養したのち、あるいは直接、生き残りをプレート上で単離するくらいしかないのではないでしょうか。 プレートに不適切な抗生物質がはいっていたりはしないでしょうね。

(無題) 削除/引用 No.325-4 - 2011/04/22 (金) 13:14:00 - ~ >生えない原因は何でしょうか？ ストックを作った時点で全滅に近いほど殺しているか、 ストックを起こす際に大腸菌が増えない条件にしてしまっているかのいずれかの可能性が高いと思います。 >きちんと菌液の濃度を測定してｽﾄｯｸするべきだったのでしょうか？ 濃度を測定する必要は無いと思いますが、 一晩培養したのではなく、濁った程度でストックしたのでしょうか？ もっと濃くていいと思いますが。 >LB plateに画線し 使用したプレートには抗生物質が入っていますか？ 入っている場合、その大腸菌はその抗生物質存在下で増殖できますか？ >このｸﾞﾘｾﾛｰﾙｽﾄｯｸから大腸菌を起こす方法が何かあれば教えていただけないでようか？ 起こした操作に問題がないのでしたら、ストックの作り直しを前提に考えて対応することになると思います。 プレートに全量を撒いたり、LB液体培地に全量を放り込み、生きている菌が僅かでもいれば、それを増やして取ってはいかがでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.325-3 - 2011/04/22 (金) 12:20:58 - 大腸菌 おおさん ありがとうございます。 すみません…書くのを忘れていました。 付け足します。 ﾌﾟﾗｽﾐﾄﾞが目的ではありません。 ｹﾞﾉﾑDNAが目的です。 大腸菌関係の実験は初めてでちゃんとした指導者もおりません。 ご指導いただければ幸いです。

(無題) 削除/引用 No.325-2 - 2011/04/22 (金) 12:02:40 - おお 大腸菌のプラスミドが目的であれば、ストックを全部溶解して培養せずにミニプレップしてください。得られたプラスミドは面倒ですがもう一度トランスフォーメーションして数個ひろってマップ通りか確認してください。 ちょっと強引なやり方ですが。

ｸﾞﾘｾﾛｰﾙｽﾄｯｸ 削除/引用 No.325-1 - 2011/04/22 (金) 11:47:29 - 大腸菌 大腸菌を培養してｸﾞﾘｾﾛｰﾙｽﾄｯｸを作製し-80℃で保存していました。 LB plateに画線し37℃で培養しましたが、生えてきません。 ｸﾞﾘｾﾛｰﾙｽﾄｯｸの終濃度は20%で、大腸菌液は濁りが目視できる程度でｽﾄｯｸしました。 生えない原因は何でしょうか？ きちんと菌液の濃度を測定してｽﾄｯｸするべきだったのでしょうか？ このｸﾞﾘｾﾛｰﾙｽﾄｯｸから大腸菌を起こす方法が何かあれば教えていただけないでようか？

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