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(無題) 削除/引用 No.326-11 - 2011/04/26 (火) 10:53:18 - Rumi >カイさん stableなlineの作製についても考えたのですが、使用しているkitではstableなlineはできないようでした。カイさんのおっしゃる通り、レンチウイルスを得るためだけならstableを作る利点はなさそうですね。 掲示板での書き込みについてのご指摘ありがとうございました。以後気をつけたいと思います。 ＞opsさん 書き込みありがとうございます。 私が使用しているkitはご察しの通り、パッケージング用のベクターがTREを持っていて、 tTAも共発現させることによってより高発現な誘導を行う系になっております。 私は通常培養のときから、テトラサイクリン不含の血清を用いた培地で培養しているのでその点につきましては問題ないと思います。 説明が不十分でしたことをお許しください。 そうですね。カイさんからもご指摘があった通り、やはりトランスフェクションがうまく行われていないのだと思います。 検鏡時のフィルターについてですが、適するフィルターがない場合はコンフォーカルで波長をしぼってみています。非特異的な蛍光も見られないのでとりあえずはトランスフェクションを中心に、プロトコールの見直しを行っていきたいと思います。 皆様、本当にありがとうございました。この掲示板で皆様から頂いた情報を参考にして、レンチウイルス作製を続けていきたいと思います。また、問題？進展？があれば再度書き込みをさせてください。

(無題) 削除/引用 No.326-10 - 2011/04/25 (月) 22:06:05 - ops あの〜、横から失礼致します・・・。 ほとんど、カイさんが説明されているので、 あまり言うこともないのですが、 >なお、トランスフェクションした細胞は、kitが推奨する細胞である、Lenti-X 293T細胞です。 >トランスフェクション後、１２時間後に新鮮な培地(DMEM/10 この血清は、テトラサイクリン不含のもの) に置き換え、その後、48時間から72時間培養した上清を、感染実験に用いました。 なーんでテトラサイクリン不含血清を使っているのだろうかと、不思議に思い、 少し添付文書を見てみたところ、 パッケージング用のベクターがTREを持っており、 tTAも共発現させることにより発現誘導を行う、 ちょっと変わった系なのですね。 で、気になったのは、 どのタイミングから、テトラサイクリン不含血清の培地にしているかなという事です。 もし通常の培養では、普通の血清を使っているのならば、 293T細胞を継代してトランスフェクション用に準備する時に、 細胞を15mlか50mlチューブに回収して、遠心して、 PBSで懸濁＆遠心による洗浄を２回くらいして、 テトラサイクリン不含血清の培地に懸濁して 細胞をまいた方がいいと思います。 トランスフェクション後から、テトラサイクリン不含血清の培地に替えようとしても、 単に培地を交換しただけでは、普通の血清中のテトラサイクリンは完全には除けませんし、 PBSで洗おうものなら、293T細胞は接着性が低かったと思いますので、 はがれてくると思います。 もし通常の培養でも、テトラサイクリン不含血清を使っているのでしたら、 上記の事は忘れて下さい。 ただ、それにしても >このトランスフェクションした293T細胞での蛍光は、少数ではありますが観察されました。 と書かれてますので、 トランスフェクション効率も低いのでしょうね・・・。 あと、EBFP、EYFP、DsRedを観察する時の蛍光フィルターも、 正しいものを使っているでしょうか？ 特にEBFP。

(無題) 削除/引用 No.326-9 - 2011/04/25 (月) 20:55:21 - カイ 確かにレンチウィルスやレトロウィルス作成でステーブルなトランスフェクションをしている人もいますね。 私自身はやったことがないので、ちょっとわからないです。 原理的にはパッケージング用のベクターも含め３〜４種のプラズミドが同時に入った細胞をセレクトしないといけないでしょう。３〜４種の薬剤が必要になるのか？とか思ったりもします。 パッケージング用のベクターは既にステーブルに組み込まれている細胞というのもレトロウィルス用なら市販されています。レンチウィルスはわかりませんが、売っているかも。 そこに自分のプラズミドを入れて薬剤選択をかけているという人はいます。 ここから先は、するかしないかは研究者個人個人のくせや好みや得意不得意でやり方が違うというだけであって、なにが正しいとか間違っているということではありません。 ただ、私はいくつかの理由で、そうしませんでした。 １、一般的にはステーブルなトランスフェクションは、トランジエントなトランスフェクションによる発現しすぎによるノンスペシフィックなトキシシティを避けるときに行う手であり、トランジエントよりマイルドな発現が得られる。この場合はマイルドな表現型を見たいわけではなく、とにかくたくさんウィルスを作りたいのだから、発現を下げたくない。 ２、２９３Tのような、90％以上のトランスフェクション効率が得られる細胞であえてステーブルを作る意義が（私にとっては）あんまりない。 ３、ステーブルは一般には7〜10日待つ。それが面倒。 一度にたくさんウィルスを作っておけば、半年〜1年は思う存分実験できますし、毎回トランスフェクションするのもそんなに手間ではないですからね。 それよりステーブル作ることのほうが、私には面倒だったんです。 ここから先は、するかしないかは指導教官の方のやり方や好みにもよりますから、よく相談なさってください。 あと、余計なことですが、研究者によってやり方が違う以上、広く皆さんに意見を求められたほうが、Rumiさんにとっても有益だと思います。 個人名指摘での質問だと他の方々からのご意見をいただきにくくなるでしょう。そこは（無題）にしておいたほうがいいと思います。

カイさんへ 削除/引用 No.326-8 - 2011/04/24 (日) 12:05:31 - Rumi おはようございます。 目的遺伝子を挿入したベクターは、９kbくらいなので、ベクターが大きすぎると言うことはないのかなっと思います。また、クローニングに関しましても、コンピはstbl3を使用しておりますので利コンビネーションの問題も考えにくいです・・・。 ＞「プロモーターと目的遺伝子との距離が問題だからそこのところを短くして改善した」というような論文がある これに関して、私も先生からお聞きしたことがあるのですが一般的なプラスミド内のMCSを利用したクローニングなので、あまり考えたくないポイントだと思っていました（汗 ひとつお聞きしたいのですが、293T細胞にトランスフェクションした後、抗生物質でセレクションをかけた場合、生き残った細胞の内すべての細胞において導入した目的遺伝子が発現しているものでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.326-7 - 2011/04/23 (土) 23:42:41 - カイ 目的遺伝子を入れたベクターが大きすぎると厄介だったりしますね。 レンチウィルス用の発現ベクターは往々にして大きいのですが、そこにさらに発現用遺伝子を組み込むとさらに大きくなり、まずクローニングが大変。 さらに、トランスフォームした大腸菌のストレーンによっては、リコンビネーションを起こして目的遺伝子部分をすっ飛ばした小さいプラズミドを作ってくれたりします。(ちゃっかりアンピシリン耐性部分は残っているのでコロニーになります。）DH５アルファはダメで、stbl3などを使わないといけないのはそういう理由です。 でもRumiさんの場合はシークエンスで確認もされてるので、そこのところの厄介さはクリアされてますね。 さらにレンチウィルスを作成した後の肝心の目的遺伝子を発現させるところでも、元々のベクターが大きいと厄介と聞いたことがあるのですが、そこのところは自分では確認していません。 「プロモーターと目的遺伝子との距離が問題だからそこのところを短くして改善した」というような論文があるとも聞いたのですがちょっと今その論文が手元になく、不確かです。 全体で何ベース以下じゃないとうまくできないとかも言っていた気がしますが… 私自身は、８kbのベクターで８０kDのタンパクを発現できていたので（インサート込みのベクターサイズは１０kb〜１１kbで）大丈夫でした。 IRES-DsRedが入って8kbのベクターだったのですが、DsRedも発現していました。

カイさんへ 削除/引用 No.326-6 - 2011/04/22 (金) 21:11:41 - Rumi 細胞の形態についての説明ありがとうございました。 確かに、293T細胞は手足をよくのばして接着していますが、ウイルス作製をしたとき、若干痩せていた印象もありました。 一度、細胞の形態を良く観察してから再度トランスフェクションを試みてみたいと思います。 濃縮kitは、ある溶液を混合して、１時間ほど低速遠心をすることによって短時間で濃縮が可能というものなので、元のウイルス溶液の体積は選びません。 私が使用しているウイルス作製kitは、kitの都合上、φ100mm　dish１枚に、10mlの培地でレンチウイルスの作製を行います。 なので、この体積で遠心による濃縮を行っても、ペレットが確認できなかったのも納得です・・・。 貴重なご意見ありがとうございます。 重ねてお聞きしたいのです。 ウイルスが感染し，目的の遺伝子を発現させるのがレンチウイルス作製の目的だと思うのですが、遺伝子の組み換えの際に、留意しなければならないことや経験上つまづいたことがある点はありますでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.326-5 - 2011/04/22 (金) 20:48:14 - カイ 細胞のいい状態とは…見た感じで、こういうのがいい感じ、というのを覚えて慣れるしかないので説明が難しいですが… 293Tはぶ厚めで丸めの細胞ですが、すべての細胞が真ん丸くなってしまうとダメです。接着性の細胞が丸くなるのは往々にして調子が悪いサインです。 全体的にぶ厚めで丸めではあるんですが、ちゃんと手足を伸ばして接着している状態。 あと、接着して伸びていても、痩せている状態は栄養不足です。 色が黒すぎず、分厚い部分につやがあって、細胞同士が適度に触れ合っている80％くらいの密度が最高かな。 先輩や先生にいい状態の細胞を見せてもらって目で覚えていくしかないですが。 細胞種によって形態は違いますし、同じ名前のcell lineでもlab lineといって継代している場所が違えば形態が変わってきているのもありますしね。 293Tと言っても今は、ウィルス作成用にいろいろバリエーションが出回っていますから、私の知っている293Tのベストな見た目と、Rumiさんがお持ちの細胞のベストな見た目は若干違うかもしれません。 また調子が悪くなると元に戻すのは難しいですから、ストックに戻ってやり直すのも手ですね。 継代数の少なく調子がいいうちに、たくさんストックを作っておいて、起こした細胞はいい状態でキープし、悪くなればストックから起こしなおして継代。 調子のよさとトランスフェクション効率はとても関連します。 私はｐEGFPなどで効率をチェックしてから、レンチ用に大規模発現しています。 大規模発現で思い出しましたが、どれくらいの大きさのディッシュでウィルスを作成していますか？ 濃縮キットは使ったことがないのでわかりませんが、超遠心してウィルスのペレットを見ようと思ったら、10cmのディッシュ2枚は少なくとも必要だったと思います。

カイさんへ 削除/引用 No.326-4 - 2011/04/22 (金) 20:15:08 - Rumi こんにちは。 早速のお返事ありがとうございます。 ＞「少数ではありますが観察されました」とありますが、この蛍光は強いものなのでしょうか？何時間後に観察されましたか？ こちらについてですが、トランスフェクションした細胞の蛍光は、ほとんどが弱いものでした。まれに強い蛍光を発するものがありましたが蛍光を発している細胞のうち、大半はうっすらと蛍光がみられるものでした。また、これらはトランスフェクションから48時間後に検鏡した際の観察結果です。 ＞〜というわけで、最初の２４時間後くらいに見える蛍光は９０％以上が望ましいということです。 とても分かりやすく教えていただきありがとうございます。現状では強い蛍光がほぼ見られないので、やはりトランスフェクションに問題があると考えた方が妥当でしょうか。 ＞次に、濃縮方法がうまくいっているかの確認ですが、濃縮前の培養上清も感染させてみて試してみてはどうでしょうか？ ご指摘ありがとうございます。実は、濃縮前に一度感染実験を行いました。しかし、感染したと考えられる細胞は全く見られませんでした。私が使用しているkit は、濃縮不要でも高力価が得られるといううたい文句で売り出されています。なので、培養上清をろ過した後に感染させてみてもそれなりに蛍光を発すると考えていたのですが・・・今回のような結果になってしまっています。 ＞ウィルスに自分のベクターが入る割合を増やすために、トランスフェクション時の2〜3種類のベクターの割合を工夫して改善したりします。 今回私が使用しているkitは、レンチウイルス作製に必要なベクターの割合が最適になるようにプロトコールが作られています。具体的には、目的の遺伝子を組み込んだベクターのみを用意し、他のベクターはpremixとなっており、それらを混合してトランスフェクションする形になっています。 カイさんがおっしゃるように、簡易力価測定のkit では、目的の遺伝子を含まないウイルスやウイルスのタンパクも検出してしまう恐れがあるので、一概に正確であるとはいえませんよね。 ＞とりあえず、まずはトランスフェクション効率を上げてみてはいかがでしょうか？ ひとつお聞きしたいのですが、トランスフェクションする細胞である293T細胞のいい状態というのは具体的にどのような状態を指すのでしょうか？また、293T細胞の状態によって、トランスフェクションの効率は大きく変動するのでしょうか？ 質問ばかりで申し訳ありませんが、宜しくお願い致します。

(無題) 削除/引用 No.326-3 - 2011/04/22 (金) 19:40:04 - カイ こんにちは。 まず、ウィルス作成時のトランスフェクション効率が気になります。 「少数ではありますが観察されました」とありますが、この蛍光は強いものなのでしょうか？何時間後に観察されましたか？ ウィルス用のベクターをトランスフェクションした際にも目的のたんぱく質は発現します。通常の動物細胞発現用ベクターを使った時と同じく、この蛍光の発現は〜２４時間後には見えるはずで強いものです。このときの発現は９０％以上はいっていることが望ましいです。 ４８〜７２時間後にはウィルスができてくるので、できたウィルスが周りの細胞に感染してゲノムに入り、目的のたんぱく質を発現しますが、この発現は前述のものより弱くなります。 たとえば、３０％位のトランスフェクション効率だったとしても、周りの細胞にウィルスが入り、発現するので、４８〜７２時間後には３０％位の明るい細胞と９０％くらいのうっすら光る細胞が観察されることがあります。 でもうっすら光る細胞は感染されただけで、ウィルスを作成していないので、役に立たず、得られたウィルス量は少ないということです。 厳密に言うと３０％のトランスフェクションが入った細胞ですら、この場合蛍光タンパクの乗ったベクターが入ったと保障するだけですから、実際のウィルス作成には同じ細胞にパッケージング用にベクター（ものによって２種か３種）も同時に入ったものだけが関与すると考えると、すべてのベクターが同時に入ったものの効率は３０％より下がります。 というわけで、最初の２４時間後くらいに見える蛍光は９０％以上が望ましいということです。 次に、濃縮方法がうまくいっているかの確認ですが、濃縮前の培養上清も感染させてみて試してみてはどうでしょうか？ ２４ウェルのプレートに、２９３Tでいいのでまいてみて、培養上清１００マイクロリットル〜２００，４００，８００くらいのスケールで感染させて、光った細胞数から大体の力価は判定できるはずです。 同様に濃縮後のウィルス液も１マイクロリットル〜５０マイクロリットルくらいのスケールで判定します。 4.6×10^5 程度ですとわりと低いですので、２４ウェルにまいた細胞数と自分のウィルスの力価とで計算してポジティブが判定できそうな（何割光っているという判定です）量を計算してテストする必要がありますが。 また、ウィルスの力価測定キットで計測できるのは、「ウィルスの存在数」です。「存在するウィルスが、自分が使いたいベクターも持っているか」は保障しません。つまり、パッケージングベクターだけを含む細胞が作成した空ウィルスなんかも数えてしまうのです。 ウィルスに自分のベクターが入る割合を増やすために、トランスフェクション時の2〜3種類のベクターの割合を工夫して改善したりします。 それと、「存在するウィルスが、感染能を持ったものか」という問題もあります。つまり、せっかく作ったウィルスが不活性になって感染しなくなったりすると、キットでは確認できても実際の力価はもっと低いということもあります。 とりあえず、まずはトランスフェクション効率を上げてみてはいかがでしょうか？トランスフェクション効率は、使っている細胞の状態に依存しますので、オーバーグロースさせないで30〜90％コンフルエントなものを定期的に（グロースの速さによりますが２９３Tは早いので2〜3日）継体して、継体数が低めのものを用いて、いい状態でまいたものをトランスフェクションに使えば90〜100％のトランスフェクション効率は得られます。

レンチウイルス作製について 削除/引用 No.326-1 - 2011/04/22 (金) 17:38:27 - Rumi 初めまして。私は大学院生で、題名にもあるようにレンチウイルスの作製を行っているRumiと申します。どうぞよろしくお願い致します。 現在の研究テーマで卒論を行ってきて、そのためにはレンチウイルスの作製が必要となってきます。 昨年からレンチウイルスの作製を始めて、今年に入って始めてパッケージング細胞にトランスフェクションするところまでできました。しかしそのウイルスが含まれる上清を、濃縮試薬による濃縮や、遠心による濃縮を行っても感染は確認できませんでした。 作製しているレンチウイルスは、clontechのLenti-X™ HTX Ecotropic Packaging System を 用いています。 このkitに利用するベクターは、pLVSIN-CMV Neo Vector のMulti Cloning Site（Xba�Tで１cut） に 、pEBFP,pEYFP,pDsRed をXba�T で２cutしたフラグメントをそれぞれ挿入し、シーケンスによってフラグメントの方向を確かめたものを使用しています。１種類のレポーター遺伝子を持ったレンチウイルスを３種作製しました。 なお、トランスフェクションした細胞は、kitが推奨する細胞である、Lenti-X 293T細胞です。 トランスフェクション後、１２時間後に新鮮な培地(DMEM/10 この血清は、テトラサイクリン不含のもの) に置き換え、その後、48時間から72時間培養した上清を、感染実験に用いました。 このトランスフェクションした293T細胞での蛍光は、少数ではありますが観察されました。 なので、組み込んだレポーター遺伝子が変異を起こしているとは考えにくいです。また、ウイルス溶液を濃縮した後に簡易力価測定kit（Lenti-X™ GoStix™） で測定したところ、 4.6×10^5 程度だと分かりました。 これらのことから、パッケージ細胞から目的の遺伝子を持ったレンチウイルスが産生されていないことが考えられますが、どの段階でうまくいっていないのかが分からなくなってしまい、困っています。 皆様方の知恵と経験をご教授ください。宜しくお願い致します。

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