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解決 削除/引用 No.334-15 - 2012/01/04 (水) 14:49:31 - doctor RAW264.7がLPSで活性化されない理由が明らかになりました. 細胞がコンタミを起こし, 新しく起こした細胞もきちんと増殖していなかったことが原因でした. しかし, 新しく購入した細胞(理研)もなかなか増殖しなかったのですが, DMEM High glucose, 1%ペニシリンーストレプトマイシンーグルタミン, そしてFBSを20%に上げて1つのフラスコに培養したところ, きちんとした大きめの細胞が増え, ２代目で2つのフラスコに, 3代目で4つのシャーレにまで増殖し, 10%FBSに戻しても増殖に問題はありませんでした. LPSでRAWが活性化されましたし, もう問題はないかと考えられます. 返信して頂いた皆様方に深く感謝致します. 大変勉強になりました.

(無題) 削除/引用 No.334-14 - 2011/06/08 (水) 01:06:23 - うえお 一度別ロットのfcsを試されては？lpsの反応性にしてもセラムの中の lps binding proteinの含量が変われば反応性も変わります。 牛の何らかの因子の影響もあるでしょうしハズレロットを つかまされてないか一度チェックする価値はあろうかとおもいます。 出入りの業者さんに、同一ロットの売上状況や、免疫やっているところの ロットをおしえてもらって同じのをつかうとか。 ロットチェックはしているとはおもいますが、新しい細胞を使うときの注意点として あえてかかせていただきました。

raw264.7の培養法法について 削除/引用 No.334-13 - 2011/06/06 (月) 16:21:08 - doctor 返信遅くなってしまい, 申し訳ありません. 皆様のご意見を拝見致しまして, 新しい細胞を取り寄せる事にしました. しかし, 3代目あたりから細胞が育たなくなってしまいました. 再び, 皆様に培養方法を確認してもらいたく, 投稿しました. 以下, 培養条件です. RAW264 : 理研から購入 培地: DMEM (invitrogen) (FBS10%(非動化済), PSG1%) 1.0×105cells/mlになるようにフラスコに5mLずつ入れ, 5%CO2大気中37℃で培養 3~4日に一回, 継代. 1~2代目はしっかり接着して, スピンドル型になっていることを確認. 3代目から浮遊し, 培養速度も落ちました. 以上です. 宜しくお願い致します.

(無題) 削除/引用 No.334-12 - 2011/04/26 (火) 19:13:42 - himawari RAW264.7は形質が変化すると浮遊細胞の割合が多くなります。 この場合、LPSへの反応性も低下することがあります。 （経験あります） 継代するときの細胞数が多いとこういった浮遊細胞の割合が多くなる傾向があるようです。 まいてから6〜8時間もあれば接着するので、まいてから次の日に浮遊しているのは品質に問題あるかもしれませんね。 stockを起すか新しい細胞を取寄せた方が早いかも。 ちなみに浮遊細胞が多いと各種サイトカインの応答性も低下します。 (RANKL、INF、MCSFとか）

(無題) 削除/引用 No.334-11 - 2011/04/26 (火) 17:03:55 - あ 私もATCCから買いましたが、1世代目から大体がフラスコにくっつきました。 セルスクレーパーで剥がして希釈して継代しているので、接着細胞を選択するようなことも特にしていません。 FACSで細胞膜マーカーの確認はできますか？

(無題) 削除/引用 No.334-10 - 2011/04/26 (火) 01:30:42 - おお >[Re:9] doctorさんは書きました : > マイコプラズマによるコンタミの可能性が高いかもしれません. > 細胞数が多いから濁っていたと考えていました. 肉眼で見えるほどになるとはちょっと思えないのですが。。。 明らかに濁っているならなんかほかのものかも知れませんよ。いずれにしろコンタミでしょうけど。 マイコプラズマが相当ひどいと長期間放置しておくとバイチが酸性にどんどん偏ってきて薄い緑っぽくなったりします。 マイコプラズマであったとしてせめてDAPIとかで感染確認と、除去されたかの確認はしてください。

(無題) 削除/引用 No.334-9 - 2011/04/25 (月) 21:40:32 - doctor マイコプラズマによるコンタミの可能性が高いかもしれません. 細胞数が多いから濁っていたと考えていました. MC210で除去したいと思います. 後日報告します. 腹腔内のresident macrophageというのはin vivoということでしょうか？ どちらかというと化学系の研究室なので, それを実施するには難しそうなのですが...

(無題) 削除/引用 No.334-8 - 2011/04/25 (月) 16:30:16 - おお >ほぼ毎日継代しないといけないくらい増殖しており, このくだりだけで考えるとマイコプラズマがコンタミしていて、増殖が促進されて同時にマイコプラズマのLPSの刺激に常時さらされて反応性がなくなっているようにも思えます。

(無題) 削除/引用 No.334-7 - 2011/04/25 (月) 15:18:10 - ダイゴ 細胞が悪いと思うのでしたら、ポジコンとして腹腔内にいるresident macrophageを使ってみたら。私の記憶ではmurine IFN-gammaは10 units/mlで十分だったと思いますが、確認して下さい。

RAWの接着の仕方とLFN-γの併用について 削除/引用 No.334-6 - 2011/04/25 (月) 11:39:03 - doctor ATCCの写真ありがとうございます. やはり, RAWをきちんと接着させないとだめだということが分かってきました. しかし, そのスピンドル型にするためには, どのくらい時間がかかるのでしょうか？ 何回も, 浮遊細胞を捨てて接着細胞だけを集めて継代するというのは, 前にやったことがあるのですが... 因に, 現在10代目で, セルバンカーで保存していた2~3代目の細胞を起こしたこともあります. 培養の仕方が悪いのだと思っています. 確かに, IFN-γの併用で細胞を刺激する文献もよくみかけます. ただ, 文献が悪かったのか, 併用でも単独でもそこまで大きな差はみられなかったような気がして, じゃあ, 単独でもいいやということになり, 現在LPS単独で行っているという背景があります. しかし, 併用でやってみる価値はあると考えています. 質問なのですが, IFN-γはどのような種類, 濃度で用いればよいのか, 又, 実際にはLPS単独よりもどのくらい増強するのか, 覚えている限りで結構ですので, 御指導ください.

(無題) 削除/引用 No.334-5 - 2011/04/25 (月) 01:55:37 - わ macrophage系の細胞からNOの産生を見るには、LPS単独では困難で，LPS+IFNgが必要だったと思います。10年くらい前の審良ラボの論文では複数の論文で、そうやって細胞を刺激していましたし，実際、再現性はありました。

(無題) 削除/引用 No.334-4 - 2011/04/24 (日) 21:04:53 - あ 浮遊はしていません。ATCCの写真のような感じです。 http://www.atcc.org/Attachments/2005.jpg スピンドル型の細胞と丸い細胞が混ざってますがどちらも強く接着しています。フラスコをたたくくらいでははがれないです。サイトカインはLPSに反応して問題なくの産生します

RAW264.7の増殖速度 削除/引用 No.334-3 - 2011/04/24 (日) 20:21:46 - doctor 質問なのですが, 週２回の継代で済むRAWというのは, きちんと接着しているのですか？ 私のは浮遊ばかりで, 浮遊を捨てて接着しているものを継代しようとしても, 接着している細胞があまりにも少なくて, 結局浮遊している細胞も集めて継代してしまっているので, アッセイがうまくいかないのはそこに問題があるのかなと最近考えているのですが...

(無題) 削除/引用 No.334-2 - 2011/04/24 (日) 19:58:04 - あ Raw264.7細胞って、毎日継代しないといけないくらい増殖速度は速いのですか？　私のは比較的遅いのですが。。。週に2回くらいの継代です。

RAW264.7がLPSで活性化されないことについて 削除/引用 No.334-1 - 2011/04/24 (日) 13:32:28 - doctor RAW264.7をLPSで活性化させて, 炎症性メディエーターを測定しようとしている者です. しかし, うまくLPSで活性化されていないようなのです. まず, NOの測定をgriess法で確認したのですが, 検出されませんでした. Griess試薬が良くないのかと考え, 亜硝酸ナトリウムと反応させたところ, きちんと濃度依存的にNOを検出している事が分かり, griess試薬には問題がないことが分かりました. では, 細胞が死んでいるのかと考え, MTT法及び顕微鏡での確認で検討しましたが, 問題なく生存していることを確認しました. LPSが悪いのかと考え, いくつかの種類で試してみましたが, いずれも改善する事は出来ませんでした. 以下に, LPSの種類を並べます. LPS (E. Coli. O55B5(γ-irradiated)), Sigma):DMEMに溶かし, 1 μg/mLに調製. LPS (E. Coli. O26B6(γ-irradiated)), Sigma):DMEMに溶かし, 1 μg/mLに調製. LPS (E. Coli. O111B4(γ-irradiated)), Sigma):DMEM(FBS (-))に溶かし, 1 μg/mLに調製. LPS (E. Coli. O55B5(gel filtration)), Sigma):DMEMに溶かし, 1 μg/mLに調製. ここまでくると, 細胞自体に問題があるように感じるのですが, ATCCから細胞を購入したばかりで, ほぼ毎日継代しないといけないくらい増殖しており, 問題はなさそうに思われます. どこに問題があるのか分からず, 上の人も考えあぐねており, ここで質問させていただきました. 御指導宜しくお願いします.

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