BioTechnicalフォーラム [18Sのシークエンス]

18Sのシークエンス

No.357-TOPIC - 2011/05/01 (日) 12:13:34 - ゆきやこんこ

動物の18S rDNAの配列（約1800 bp）を複数の種で決定したいと思っています。
1種の配列が分かっているので、自分でプライマーを作製し、ダイレクトシークエンスで読み進めているのですが、行き詰ってしまったので相談させてください。
私は、1800bpの中に、約300bpくらい増幅する10組のプライマーを作製しました。
ただ、ダイレクトシークエンスをするとフォワードプライマーで読んだ配列とリバースプライマーで読んだ配列の重なりが150～200bp程度と思ったより少ないです。
プライマーを設計して細分化して読んでいくべきか、クローニングするべきか、または、シークエンス用のプライマーを設計するべきか、悩んでいます。
経験ある方のアドバイスを頂きたいです。
よろしくお願いします。
　

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No.357-5 - 2011/05/03 (火) 12:23:04 - おお

波形がしっかりとしていたら完全に裏のシーケンスをとる必要もないのではと思います。裏表で読めているところで100%合致しているわけですから、それが正確さを示しているのではないでしょうか。

PCRしたあとにシーケンスする方が確実と思いますがそちらの方がさらにうまくいってないのですね。500は読めると思うんですけど。まずPCRのあにいリングの温度がバンドが出なくなる直前くらいまであげて、特異性をを担保してください。ゲル切出しをやった方がいいです。そんなところでしょうか。TストレッチやAストレッチ多くないですか?そういう所はもしかしたらトラブルがあるかもしれません。

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No.357-4 - 2011/05/02 (月) 09:34:46 - ンンノ

表裏を読みたいけども、片側しか読めてないところが結構たくさんあるって
ことでお悩みなんでしょうか？

お使いのDNAシーケンシングシステムの性能にもよるんでしょうけども、200bp
はちょっと寂しいですね。
鋳型DNAが多すぎたりしませんか？
10組のPCRをして10本の鋳型に20本のプライマーでシーケンス反応してますか？

1800bpをPCRで増やして、これを20本のシーケンスプライマーで読むほうが、
手間も少なくて得られる情報も多いと思います。
ご検討ください。

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No.357-3 - 2011/05/01 (日) 17:14:26 - ゆきやこんこ

おおさん
早速のご回答、ありがとうございます。
肝心なことを書き忘れてしまったのですが、10組のプライマーを使っても、1800bpに穴ができてしまうのです。
オーバーラップしている部分の整合性はほぼ100%です。
ただ、フォワード、リバースのそれぞれで約300bpのシークエンスが得られているのに、オーバーラップしているのは150bpくらいしかなく、それぞれのプライマーでオーバーラップした部分を集めても、約1800bpの配列のうち一部をカバーすることができずにいます。
500bp以上をターゲットにしてプライマーを作ると、PCRで増えても、シークエンスがうまく読めないのは、プライマーが悪いのでしょうか。

(無題)

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No.357-2 - 2011/05/01 (日) 13:18:03 - おお

ダイレクトシークエンスの波形データーなどあまり見たことがないのですが、、、それぐらい重なっていればまず大丈夫でないでしょうか。
裏向きの配列から表の配列のコンファームができないということでしょうか?
ちなみにそのオーバーラップしているところどの程度表裏で整合性がありますか?

18Sのシークエンス

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No.357-1 - 2011/05/01 (日) 12:13:34 - ゆきやこんこ

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