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(無題) 削除/引用 No.406-9 - 2011/05/30 (月) 15:00:07 - スレ主です いつもレスありがとうございます。 アドバイスの通り やってみます。

(無題) 削除/引用 No.406-8 - 2011/05/30 (月) 10:33:08 - ぽー 使われるSequencerとシステムがわからないので何ともいいかねますが、 以前やっていた時には前後100bpあれば前後から解析するのには問題ありませんでした。 最近はreal time PCRベースだったりMassベースだったりする解析手段も増えていますから、 すでに目的のSNPが決まっていて、あとは解析を行うだけでいいのなら、 Sequenceで行うよりも（機器がそろっていれば）コストも安く時間も早いと思います。 その場合も一番初めは一部のサンプルをSequenceをかけてReal timeなどと結果が一致することの確認は必要になりますが・・・

(無題) 削除/引用 No.406-7 - 2011/05/25 (水) 16:14:36 - スレ主です スレ主です。ご丁寧なメールをありがとうございました。 おっしゃる通りで、詳細は言えないのですが 非腫瘍部のDNAのSNP解析を行おうとしているところです。 ちなみに1st　PCRは SNP場所をどの位囲い込むprimerを設計されてらっしゃいましたでしょうか？ SNP場所を中央に、300bpずつ前後に計600bpほどのアンプリコンでやってみようと思っているのですが、経験がないもので もし具体的にうまくいったケースを教えていただけましたら 幸いです。

(無題) 削除/引用 No.406-6 - 2011/05/23 (月) 10:24:21 - ぽー 以前ルーチンで癌のSNP解析をしていました。 その時は DNA抽出 ↓ 1st PCR ↓ EXO/SAP処理 ↓ Sequence PCR という流れで行っています。 ただ、 >ある腫瘍組織からゲノムDNAをとって、ある特定部位のSNPをシークエンスで確認したいと思っています と書かれていますが、 これではSNPの解析はできません。 腫瘍組織内であればゲノムに変異が入っている可能性もあり、検出されたものがSNPとしてもともとゲノム中にあったものなのか、それとも腫瘍ができてから変異が入ってしまったものなのかの区別をつけることができないからです。 ですので、通常のSNP解析においては非腫瘍組織（血液など）からDNAを抽出するのが一般的になっていると思います。

(無題) 削除/引用 No.406-5 - 2011/05/17 (火) 14:49:06 - ~ プライマーだけ除けばいいのであれば、カラム精製で除けます。 ExoSAP-ITの方が楽かもしれません。 非特異バンドがシークエンシングに影響する場合は、切り出すことで非特異バンドを除けます。 ただ、切り出すのではなくnested PCRにより非特異バンドの持ち込み量を減らすことでも改善する場合があります。 切り出し時のコンタミよりも、希釈時のコンタミの方が少ないと思いますので、サンプル数が多い場合はnestedが有利になるかと思います。

(無題) 削除/引用 No.406-4 - 2011/05/17 (火) 14:13:02 - スレ主です レスありがとうございます。 ゲノム鋳型のPCR産物をカラム精製かゲル切り出しで精製してから シークエンスPCRをかければよいということですかね。 素人ですいませんがアドバイスをお願いします。

(無題) 削除/引用 No.406-3 - 2011/05/17 (火) 12:50:45 - ~ 非特異バンドの影響を除くための、バンドの切り出しやnested PCRのことですかね？ その様な解析をされているのですから、他のグループの同じような解析の報告は読んでいますよね。 それが参考になるのではないでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.406-2 - 2011/05/17 (火) 10:30:42 - ンンノ >リニアのDNAはシークエンスPCR時に一工夫必要らしい 聞いたことがありません。 PCRプライマーをシークエンス反応系に持ち込まないように注意する必要 はあります。

組織からDNAシークエンス 削除/引用 No.406-1 - 2011/05/17 (火) 00:14:30 - 素人です SNP解析素人です。ある腫瘍組織からゲノムDNAをとって、ある特定部位のSNPをシークエンスで確認したいと思っています。組織からDNAを抽出するまではいいとして、そこからどうすればいいか、ノウハウがないのでもし経験があればぜひともご教示ください。今のところのプランとしては、ゲノムDNAを鋳型として、読みたいSNPを中央に、300bp位前後に挟むようなprimerでPCRしてから、そのPCRプロダクトを鋳型にシークエンスPCRをかけようと思っていますが、プラスミドDNAと違い、リニアのDNAはシークエンスPCR時に一工夫必要らしいとも聞いていて、全体にどういうやり方があるのかぜひとも教えていただきたいです。

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