BioTechnicalフォーラム [GST recombinant protein]

GST recombinant protein

No.43-TOPIC - 2011/02/18 (金) 22:34:03 - けんしろう

GSTタグつきのRecombinant Proteinを作製しています。Lysis buffer(1% Triton in PBS)で溶かしていますが、ソニケーション、遠心した後に上清、残りのペレットをそれぞれを回収してSDS-PAGEで発現チェックしても上清に目的のリコンビナントプロテインが溶けだしてくれません。非変性条件で作りたいのですが、これはもう諦めるしかないのでしょうか？
　

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No.43-8 - 2011/02/27 (日) 19:44:02 - ABZO

Tritonみたいなおとなしいのじゃなくて、1%CHAPSとか0.5%デオキシコール酸ナトリウムとかみたくちょっと強めのはどうよ。デオキシコール酸ナトリウムはものによってはちょっと変性する可能性はあるけど。もし等電点が強酸性オア強塩基性に偏ったものなら可溶化bufferのpHを変えてみるのもありかも。1Mくらいまで塩濃度上げてみるとかもあるね。まあどうにもだめそうなら、とりあえずこちらの方法は一時撤退して、一般的な「変性剤で可溶化しその後で再生」でやるのがいいかな。

また他の人も指摘してるように、リコンビナントをいい感じで得るためにインキュベーションの温度とか時間で発現をコントロールするのはよく聞くね。

(無題)

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No.43-7 - 2011/02/25 (金) 09:53:47 - ~

>グアニンジンや尿素などタンパクを変性させない方法
インクルージョンボディーに入っているのであれば、既に変性していますよね。
巻き戻しに変性剤を使っても、新たに変性させたと考えなくてもいいと思いますが。

始めから変性しないようにするのと、インクルージョンボディーの可溶化が混ざっていますが、
大腸菌株を変えてみる（そもそも何を使っているのか不明ですが）
タグを変えてみる
TAPS-sulfonateを使ってみる
sakaguchikengo 先生の化学触媒を使ってみる
CHPナノゲルを使ってみる
β型ゼオライトや酸化還元剤を使ってみる
上清中に含まれるタンパク質を回収・濃縮し、必要量を確保する
大腸菌以外で発現させてみる（無細胞系も含む）

(無題)

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No.43-6 - 2011/02/24 (木) 21:51:03 - けんしろう

4℃ overnight, 16℃ overnnightも試しましたが溶けませんでした。Lysis bufferに0.4 Mアルギニンを混ぜましたがそれでもだめでした。何か他に策はありますでしょうか。グアニンジンや尿素などタンパクを変性させない方法でお願いします。

これまでにどこまで検討をしたのでしょうか

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No.43-5 - 2011/02/21 (月) 14:47:48 - ~

手持ちの材料だけで出来る、低温培養の検討すらやっていないように読み取れますが。

諦めて済ませられるのであれば、諦めた方が効率がいいかもしれません、
ただ、プラスミドワークと違って、タンパク質の場合は条件検討はやるものだと思っておいたほうがいいと思います。

(無題)

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No.43-4 - 2011/02/21 (月) 14:31:03 - Boston-Pullman

過去ログに詳しく書かれている思うのでここでは簡潔に。

室温での培養は経験上有効です。